NLRP3炎癥小體在MS/EAE發病機制中的作用及其靶向治療*

楊一凡，劉立麗，聶作明，呂正兵，王 丹

(浙江理工大學 1浙江省家蠶生物反應器與生物醫藥重點實驗室， 2生命科學與醫藥學院， 浙江 杭州 310018)

多發性硬化癥(multiple sclerosis，MS)是由免疫細胞攻擊中樞神經系統(central nervous system，CNS)而造成的一種自身免疫性疾病，其具有神經元脫髓鞘、神經膠質細胞增生和軸突損傷等病理特征[1]。NLRP3炎癥小體作為一種能識別病原體和危險信號的傳感器，近年來被發現與許多自身免疫性疾病的發病關系密切[2]。本文從NLRP3炎癥小體激活的主要途徑出發，綜述了NLRP3炎癥小體在MS及其動物模型——實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)發病中的作用以及靶向治療研究進展。

1 炎癥小體

1.1炎癥小體的結構 炎癥小體是一種多蛋白復合體，典型的炎癥小體由模式識別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)參與組裝，能夠識別胞質中的病原微生物以及危險信號[3]。目前，已經發現了5種主要PRR信號轉導型受體家族，分別是位于細胞膜上的Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)和C型凝集素受體(C-type lectin receptors，CLRs)、位于胞內的維甲酸誘導基因Ⅰ樣受體[retinoic acid-inducible gene Ⅰ(RIG-Ⅰ)-like receptors，RLRs]、核苷酸結合寡聚化結構域樣受體[nucleotide-binding oligomerization domain(NOD)-like receptors，NLRs]和DNA識別受體[4]，其中NLR家族的特點是中央為核苷酸結合寡聚化結構域(nucleotide-binding and oligomerization domain， NACHT)，C-端通常為富含亮氨酸重復序列(leucine-rich repeats，LRRs)，N-端為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶募集結構域(caspase recruitment domain，CARD)和熱蛋白結構域(pyrin domains，PYD)[2]，見圖1。在NLR炎癥小體復合體家族中，NLRP3炎癥小體的研究最為廣泛，它是控制白細胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-18成熟的關鍵信號分子。

Figure 1. The schematic diagram of NLRP3 inflammasome. The NLRP3 inflammasome is comprised of three proteins: NLRP3 scaffold, adapter protein ASC, and procaspase-1. The NLRP3 is characterized by the presence of a central NACHT domain, which is commonly flanked by C-terminal LRRs and N-terminal CARD or PYD domains.
圖1 NLRP3炎癥小體結構示意圖

1.2NLRP3炎癥小體的激活信號 典型的NLRP3炎癥小體激活分為2步(圖2)，且在轉錄和翻譯后水平都受到嚴格調控。信號1為激活的啟動信號，由TLRs、NOD2、TNFR1或TNFR2激活NF-κB信號通路，而后上調NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18的表達[5]。信號2為活化信號，當細胞受到由危險信號相關分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMP)或病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)的信號刺激時，就會觸發NLRP3的自體寡聚化，并與接頭蛋白凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)進行組裝，招募pro-caspase-1進而促發炎癥級聯反應[2]。最近的研究發現高爾基體反面網絡結構(trans-Golgi network，TGN)通過其膜上富集的帶負電磷脂酰肌醇四磷酸募集處于胞質中的NLRP3，在其分散結構dTGN上組裝成NLRP3炎癥小體[6]。同時，活化的caspase-1可作用于消皮素D(gasdermin D，GSDMD)，釋放其活化的N端，介導細胞焦亡[7]。

能激活NLRP3炎癥小體的PAMP信號有很多(圖2)，真菌、細菌、病毒和寄生蟲均有此功能，如肺炎支原體[8]、白色念珠菌[9]、霍亂弧菌[10]、丙型肝炎病毒[11]及曼氏血吸蟲[12]等都能激活NLRP3炎癥小體。識別DAMP信號同樣是NLRP3炎癥小體的重要生理作用，如胞外ATP就是一種廣泛存在的DAMP信號[13]。其它如尿酸鹽結晶[14]、β淀粉樣蛋白[15]，外源環境中的二氧化硅和鋁鹽[16]等也屬于能夠激活NLRP3炎癥小體的DAMP信號。

1.3NLRP3炎癥小體的激活機制 目前，普遍認為NLRP3炎癥小體的激活機制主要有以下3種：

1.3.1胞內K+濃度的降低 K+的外流是NLRP3炎癥小體激活的特定上游條件，而Na+的流入則是非必需的[17]。當細胞受到細菌脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)刺激后，膜上的ATP通道Pannexin-1裂解，隨后ATP釋放，胞外ATP進而激活P2X7受體(P2X7 receptor, P2X7R)，同時胞外ADP激活P2Y1受體，導致胞內K+濃度下降，同時，胞外K+濃度的升高以及ATP和P2X7R的結合反過來也會進一步刺激Pannexin-1通道開放[13]。

1.3.2線粒體釋放線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)、心磷脂和活性氧簇(reactive oxygen species，ROS) 線粒體受到PAMP和DAMP信號的刺激后，會釋放mtDNA、心磷脂和ROS[18]。mtDNA是一個有著大量CpG島的環形DNA，能被CpG DNA受體TLR9所感知，從而激活NF-κB信號通路，引起NLRP3炎癥小體激活[19]。在TRPM2通道介導的Ca2+內流過程中，也會產生過量的ROS[20]。ROS是ATP刺激或顆粒物吞噬作用觸發NLRP3炎癥小體激活的關鍵，Li等[21]的研究發現ROS誘導的內質網應激反應通過誘導硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)而激活NLRP3炎癥小體。而且不同來源的ROS會以不同方式調節炎癥小體的激活。

Figure 2. Mechanisms of NLRP3 inflammasome activation. Both signal 1 and signal 2 are necessary for NLRP3 inflammasome activation. Signal 1 is activated by toll-like receptor (TLR) ligand, mediated by MyD88, caspase-8, FADD, and NF-κB, and leads to the upregulation of NLRP3 and pro-IL-1β. Signal 2 promotes the assembly of ASC and pro-caspase-1 and leads to activation of the NLRP3 inflammasome complex. A number of DAMP or PAMP, including K+efflux, pore-forming channels or toxins, Ca2+influx, ROS, mtDNA, have been proposed as the key mechanism of signal 2 activation. Once activated the NLRP3 inflammasome causes the activation of caspase-1 which cleaves the precursor proforms of IL-1β and IL-18 into their mature forms.
圖2 NLRP3炎癥小體激活機制

1.3.3溶酶體損傷導致組織蛋白酶B釋放 溶酶體損傷造成的NLRP3炎癥小體激活同樣是炎癥小體激活的主要方式之一，晶體或顆粒物等DAMP信號會誘導溶酶體破裂，導致蛋白水解酶等內容物釋放到胞質中[22]。其中組織蛋白酶B可以直接與NLRP3炎癥小體的PYD和NACHT結構域相互作用以激活NLRP3[23]。

以上的機制多數情況下會同時發生，且并沒有一種單獨通用的機制來解釋炎癥小體的激活。

2 MS與EAE

一直以來，MS被認為是一種復雜且難以辨別的自身免疫性疾病，病變主要累及大腦半球白質、小腦、腦干、脊髓和視神經[1]，其發病普遍認為是由穿過血腦屏障(blood brain barrier，BBB)和血脊髓屏障(blood spinal cord barrier，BSCB)的CD4+T細胞所引起，免疫細胞會促進炎癥發生、神經元脫髓鞘以及神經膠質增生和神經元變性[24]?；罨腃D4+T細胞存在不同的分化狀態，包括Th1、Th2、Th9、Th17、Th22和Treg細胞，所有這些CD4+T細胞亞群都參與了MS的發病，相關細胞因子IL-17A、IL-23、IL-6等也與MS的發病有著密切關系[25-26]。除此之外，Haider等[27]認為小膠質細胞的活化、ROS的產生和氧化損傷也是驅動神經元脫髓鞘和神經退行性病變發生的關鍵。

EAE是常用的MS動物實驗模型，應用該模型已開發了多種經FDA批準的治療MS的藥物。EAE在發病特征等多方面都與MS相似，兩者均因BBB和BSCB受損，免疫細胞攻擊CNS，導致病變部位出現大量炎性浸潤物以及神經元脫髓鞘、神經膠質細胞增生和軸突損傷等病理特征，但EAE也并非能完全模仿MS的發病，如在進行性MS患者大腦中普遍存在與灰質和白質彌漫性損傷有關的氧化損傷就在狨猴和小鼠的EAE中均未發生[28]。

3 NLRP3炎癥小體與MS和EAE

3.1NLRP3炎癥小體及其下游分子廣泛存在于MS和EAE中 因固有免疫系統最初執行許多適應性免疫的功能，因此，炎癥小體在MS和EAE中發揮著許多重要作用。MS患者的外周血單核細胞中caspase-1和IL-18的表達量均有所增加[29]。同樣，在EAE模型中，NLRP3、ASC、caspase-1、IL-18和IL-1β等多種NLRP3炎癥小體相關分子的表達也有所增加[30]。利用ASC-/-和caspase-1-/-小鼠建立EAE模型，結果顯示這些小鼠的發病情況同野生型小鼠相比均明顯減輕；同樣，由NLRP3-/-小鼠建立的EAE模型也表現出炎癥反應減輕，髓鞘脫失情況下降的趨勢[31]，且已有研究證實NLRP3炎癥小體通過促進炎癥細胞向CNS遷移來控制疾病進展[32]。由此可見NLRP3炎癥小體在MS和EAE的發病中起著重要作用。

3.2EAE發病中影響NLRP3炎癥小體激活的細胞因子 在EAE發病中細胞因子會影響NLRP3炎癥小體的激活。由樹突狀細胞表達的胞外核苷酸酶CD39可以水解胞外ATP，使得胞外ATP造成的促炎癥環境轉變為腺苷誘導的抗炎癥環境，從而抑制NLRP3炎癥小體的激活[33]。近期的一項研究顯示，阻斷CD47也能影響NLRP3在EAE中的激活，在CD47缺陷時會導致一氧化氮(nitric oxide，NO)增加，NO會抑制NLRP3依賴性IL-18的產生[34]。粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF)是炎癥小體的正向調節物，通過增強ASC和pro-IL-1β的表達來增加IL-1β的釋放，產生GM-CSF的B細胞亞群參與了MS的發病，并加劇了髓系炎癥反應[35]。與GM-CSF對炎癥小體的正向調節不同的是，干擾素β(interferon β，IFN-β)會抑制NLRP3炎癥小體的激活，目前IFN-β已經成為治療MS的一線藥物[36]。上述這些細胞因子都對NLRP3炎癥小體有重要的調控作用。

3.3IL-1β在MS和EAE中作用 在EAE的初始階段，抗原呈遞細胞誘導CD4+T分化為Th1和Th17，從而將固有免疫反應和適應性免疫反應連接起來[37]。T細胞抗原受體激活pro-IL-1β表達，促使ASC從細胞核轉運到細胞質，極化的Th17細胞表達IL-1受體(IL-1 receptor，IL-1R)，而后產生活化的IL-1β，值得注意的是，此時IL-1β是由ASC-NLRP3依賴性途徑中的caspase-8所激活[37]。IL-1β在MS和EAE的發病早期穿過BBB進入腦脊液(cerebro-spinal fluid，CSF)和CNS，并且能促進其它細胞因子和免疫細胞也穿過BBB[38]。微血管中的內皮細胞通過對損傷刺激和細胞因子的反應參與了神經炎癥，受到刺激后內皮細胞以IL-1R依賴途徑上調黏附分子的表達，使中性粒細胞黏附到內皮細胞，并從血液遷移到CNS組織內，而使用神經調節素-1β可以減少中性粒細胞的黏附及IL-1β的影響[39]。在MS和EAE中IL-1β的來源并不相同，在小鼠的EAE模型中IL-1β是由浸潤病灶的單核巨噬細胞產生而并非小膠質細胞；而在人和恒河猴的MS中，IL-1β似乎是由病變相關的小膠質細胞釋放，而并非來自中性粒細胞或單核巨噬細胞[40-41]。并且MS患者CSF和血液中IL-1β的水平與疾病的易感性、病情進展和嚴重程度有關[42]，而IL-18也被認為與MS發病程度有關[43]。

4 針對NLRP3炎癥小體的治療方案

4.1使用IFN-β的治療方案 目前，FDA已批準十多種治療MS疾病的修飾類藥物，在5種一線藥物中，3種為IFN-β。IFN-β通過IL-10的自分泌作用減少pro-IL-1β產生[44]。此外，IFN-β還可作用于單核巨噬細胞的Ⅰ型干擾素受體，激活細胞因子信號轉導抑制因子 1(suppressor of cytokine signalling 1，SOCS1)，SOCS1抑制Rac1活化和ROS生成后，NLRP3炎癥小體的活性也隨之受到抑制[30]。研究顯示，MS患者接受IFN-β治療后，其單核巨噬細胞產生IL-1β的水平要遠低于健康人群，同時NLRP3在mRNA水平上也有下降[45]。然而也有研究表明IFN-β在MS和EAE治療的應用中存在限制，即只有在NLRP3依賴性的MS或EAE中才能發揮治療效果[36]。

4.2針對NLRP3上游激活通路的阻斷劑 格列本脲是第1個被發現在體外具有抑制NLRP3激活作用的磺酰脲類藥物，它可抑制LPS和ATP誘導的caspase-1的激活和IL-1β的分泌[46]。JC-171作為一種羥基磺酰胺類似物，是一種特異性NLRP3炎癥小體抑制劑，具有預防和治療EAE的作用[47]。丙磺舒作為一種 Pannexin-1通道阻滯劑，普遍用于治療高尿酸血癥和痛風，但其同時可以降低大鼠星形膠質細胞中NLRP3和caspase-1的表達[48]。青蒿素已被證實可以通過抑制NF-κB信號通路發揮抗炎作用，并且在動物模型中表現出對于NLRP3炎癥小體的抑制[49]。此外，β-羥丁酸通過阻止K+外流、內質網應激和ASC-NLRP3寡聚化來抑制NLRP3炎癥小體活化[50]。3，4-亞甲二氧基-β-硝基苯乙烯是一種新型酪氨酸激酶抑制劑，能特異性阻止NLRP3和ASC的寡聚化，但不能阻斷NLRP3激動劑誘導的K+外流[51]。

4.3以NLRP3下游效應分子為靶點的治療 α1抗胰蛋白酶可以通過選擇性阻斷NLRP3以減少IL-1β表達[52]。Coll等[53]使用二芳基磺酰脲類化合物MCC950同樣抑制了IL-1β表達，減輕了EAE的發病程度，降低了EAE模型鼠的死亡率。Mckenzie等[54]的實驗證明用小分子藥物VX-765可以抑制caspase-1，使得CNS中炎癥小體和細胞焦亡相關蛋白表達減少，軸突損傷減輕，神經功能有所改善，其作用原理是通過轉染GSDMD的siRNA抑制GSDMD的表達，進而抑制小膠質細胞焦亡。此外，還可以通過骨髓源神經干細胞[55]和牙周膜干細胞分泌物[56]設計針對EAE的治療方案。

5 小結

盡管EAE和MS并不是完全相同的疾病，但是通過對EAE的研究，依然可以為MS的治療提供一些借鑒；而且EAE模型的建立直觀地展現了NLRP3炎癥小體在自身免疫性神經炎癥中的作用。雖然NLRP3炎癥小體在MS和EAE發病中的作用已被逐步認識，但是還有許多問題亟待解決：是否還有別的NLRP3炎癥小體激活物？是否有一個共同的機制來激活NLRP3炎癥小體？在不同的病灶部位NLRP3炎癥小體是如何參與發病的？能否針對NLRP3炎癥小體的自身組份(如ASC等)而不僅是針對其下游細胞因子(如IL-1β)設計治療方案？隨著我們對NLRP3炎癥小體認識的不斷深入，必將對MS和其它同類的炎性自身免疫性疾病的治療提供更有效的策略。