輕刮子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎著床因子和反復(fù)妊娠失敗患者妊娠結(jié)局影響研究

李秀娟，曾 娟，鄭雪絨

1.西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院產(chǎn)科(西安 710038)；2.西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院護(hù)理部(西安 710038)

反復(fù)妊娠失敗是指患者在妊娠早期發(fā)生≥3次的自然流產(chǎn)現(xiàn)象，1%的孕齡女性會(huì)出現(xiàn)該現(xiàn)象[1]。臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)高達(dá)50%的反復(fù)妊娠失敗患者病因不明，而多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其與子宮內(nèi)膜容受性密切相關(guān)[2]。如何提高患者子宮內(nèi)膜容受性始終為婦產(chǎn)科醫(yī)師關(guān)注的焦點(diǎn)。本研究在反復(fù)妊娠失敗患者再備孕前的月經(jīng)期，對(duì)其子宮內(nèi)膜行吸刮術(shù)，檢測(cè)胚胎著床期患者子宮內(nèi)膜中OPN、LIF、胞飲突及整合素V3的表達(dá)情況，探索以上因子的表達(dá)與妊娠結(jié)局之間的關(guān)系。

資料與方法

1 一般資料 選取2014年1月至2016年1月間我院收治的反復(fù)妊娠失敗的患者300例，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其均分為兩組。對(duì)照組：年齡(32.16±2.37)歲，不孕病程(4.52±0.59)年，胚胎移植數(shù)目(2.63±0.60)個(gè)；觀察組：年齡(31.89±2.25)歲，不孕病程(4.46±0.61)年，移植胚胎數(shù)目(2.57±0.55)個(gè)。兩組患者年齡、病程及胚胎移植數(shù)目間差異無顯著意義(P>0.05)。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：肝腎功能、血常規(guī)、甲狀腺功能檢查無異常者；小于42歲，無內(nèi)外科疾病者；男方前列腺功能及精液正常者。排除標(biāo)準(zhǔn)：近3個(gè)月內(nèi)服用過避孕藥及激素類藥物者；合并生殖道感染、輸卵管積水等疾病者。所有患者均自愿簽署了知情協(xié)議書，且本研究向醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)做了申報(bào)。

2 研究方法

2.1 輕刮子宮內(nèi)膜和微活檢：觀察組患者在月經(jīng)第2 d實(shí)施子宮內(nèi)膜輕刮術(shù)，將宮頸口用宮頸擴(kuò)張器擴(kuò)張至5.5號(hào)，然后選擇5號(hào)刮匙將宮腔內(nèi)膜的各個(gè)表面進(jìn)行淺表性搔刮；對(duì)照組患者不做任何處理。月經(jīng)第10天開始B超監(jiān)測(cè)兩組患者排卵情況，當(dāng)卵泡直徑達(dá)到18 cm時(shí)指導(dǎo)患者同房。當(dāng)B超監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)卵泡破裂時(shí)開始每日20 mg的黃體酮支持，持續(xù)到妊娠12周。患者排卵后第7天時(shí)，將一次性宮腔組織吸引管置于患者的宮腔內(nèi)，深度約6 cm，內(nèi)芯向外抽取約5 cm，利用吸引管的負(fù)壓和多孔管套從患者宮腔四壁及底部分多個(gè)點(diǎn)吸取微量宮腔內(nèi)膜組織備用。以上操作均由專人完成。

2.2 材料處理及測(cè)定方法：將上述方法取得的子宮內(nèi)膜樣本分別用生理鹽水沖洗干凈后分為2份。一份用于胞飲突的掃描電鏡分析；另一份用于OPN、LIF及整合素V3的免疫組化分析。

2.2.1 電鏡掃描觀察胞飲突：將子宮內(nèi)膜樣本加入4℃ 2%(w/v)的戊二醛聚丁二酸丁二醇酯(PBS)中固定2 h， PBS緩沖液沖洗；隨后置于4℃ 1%鋨酸PBS中繼續(xù)固定2 h后重復(fù)沖洗；乙醇逐級(jí)脫水后醋酸異戊酯漂洗2次，定位、干燥。由2人同時(shí)對(duì)每份樣本的20個(gè)視野進(jìn)行觀察，挑選5個(gè)具有代表性的視野計(jì)算其子宮內(nèi)膜表面出現(xiàn)胞飲突的面積比，5個(gè)視野的平均值為樣本的面積比：豐富，>50%；中等，20%～50%；較少，<20%。

2.2.2 免疫組化分析：子宮內(nèi)膜樣本經(jīng)常規(guī)石蠟切片包埋、切片、HE染色。按照試劑盒(上海微蒙生物科技有限公司)上的說明書實(shí)施操作。石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化及抗原修復(fù)等處理后封片；添加兔抗OPN單克隆IgG抗體、抗LIF及抗整合素V3多克隆IgG抗體，4℃下孵育過夜；二抗室溫下孵育0.5 h，同時(shí)以直接滴加二抗作為陰性對(duì)照。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行免疫組化評(píng)分：每個(gè)切片選任意5個(gè)視野觀察陽(yáng)性細(xì)胞漿表達(dá)強(qiáng)度。陰性(0分)，無染色；可疑陽(yáng)性(1分)，現(xiàn)淺黃色顆粒；弱陽(yáng)性(2分)，淺棕色；陽(yáng)性(3分)，棕黃色；強(qiáng)陽(yáng)性(4分)，棕褐色。用5個(gè)視野的平均值計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比：陰性(0分)，無表達(dá)；可疑陽(yáng)性(1分)，1%～15%；弱陽(yáng)性(2分)，16%～50%；陽(yáng)性(3分)51%～85%；強(qiáng)陽(yáng)性(4分)，86%～100%。陽(yáng)性指數(shù)=陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度細(xì)胞百分比[3]。

3 觀察指標(biāo) B檢查顯示，子宮內(nèi)可見孕囊、心管搏動(dòng)及胚芽，妊娠率=B超確診妊娠數(shù)/總病例數(shù)×100%；活產(chǎn)率=妊娠3個(gè)月后胚胎持續(xù)發(fā)育的病例數(shù)/總病例數(shù)×100%[4]。

結(jié) 果

表1 兩組患者OPN、LIF、整合素V3及胞飲突表達(dá)情況對(duì)比

觀察組患者行輕刮術(shù)前后OPN、LIF、免疫組化染色表明，OPN及LIF主要在子宮內(nèi)膜表面及腺上皮細(xì)胞中表達(dá)，患者實(shí)施輕刮術(shù)后，胞質(zhì)中遍布棕褐色顆粒，與治療前相比，表達(dá)顯著增強(qiáng)；整合素V3主要在子宮內(nèi)膜腔上皮及腺上皮中表達(dá)，在細(xì)胞質(zhì)中可見到褐色顆粒，同樣與治療前比較，表達(dá)量顯著增強(qiáng)。

電鏡掃描發(fā)現(xiàn)，所有患者子宮內(nèi)膜樣本中均有胞飲突的陽(yáng)性表達(dá)。胞飲突主要表達(dá)于面向上皮細(xì)胞的頂端膜的表面，尤其是在凹陷部位的表達(dá)更為豐富，胞飲突呈現(xiàn)單個(gè)花蕾狀，胞飲突之間隔有單纖毛細(xì)胞。

2 患者妊娠結(jié)果 如表2。觀察組患者經(jīng)過輕刮術(shù)后胚胎妊娠率及活產(chǎn)率均明顯高于對(duì)照組患者，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 兩組患者妊娠結(jié)果對(duì)比[例(%)]

表3 兩組患者妊娠與OPN、LIF、整合素V3及胞飲突表達(dá)的關(guān)系

表3 兩組患者妊娠與OPN、LIF、整合素V3及胞飲突表達(dá)的關(guān)系

討 論

子宮內(nèi)膜容受性是指子宮內(nèi)膜準(zhǔn)許囊胚侵入、定位、附著在其表面，并改變內(nèi)膜間質(zhì)使其有利于胚胎著床的生理狀態(tài)。子宮內(nèi)膜輕刮術(shù)屬于局部刺激的機(jī)械手段月經(jīng)初期輕刮子宮內(nèi)膜周壁及底部，人工創(chuàng)造創(chuàng)面，可加快子宮內(nèi)膜蛻膜化，促進(jìn)局部血管增生；促進(jìn)胚胎著床相關(guān)因子表達(dá)分泌；此外該方法清除患者子宮內(nèi)膜中的局灶性病變組織，促使子宮內(nèi)膜同步脫落，改善內(nèi)膜形態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)妊娠失敗患者在接受子宮內(nèi)膜微創(chuàng)術(shù)后，其著床率、妊娠率均顯著提高。

本研究中觀察組患者在妊娠前一個(gè)月月經(jīng)第2d采用輕刮子宮內(nèi)膜的方式進(jìn)行處理，人為刺激子宮內(nèi)膜快速生長(zhǎng)。為深入研究輕刮術(shù)與反復(fù)妊娠失敗患者妊娠結(jié)局之間的關(guān)系，本研究采用免疫組化法和電鏡掃描技術(shù)對(duì)兩組患者子宮內(nèi)膜中的OPN、LIF、整合素V3及胞飲突的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，輕刮術(shù)后，OPN、LIF及整合素V3表達(dá)較對(duì)照組均明顯增強(qiáng)，胞飲突較對(duì)照組表達(dá)更豐富，這一結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道相吻合。OPN及LIF主要在子宮內(nèi)膜表面及腺上皮細(xì)胞中表達(dá)，患者實(shí)施輕刮術(shù)后，胞質(zhì)中遍布棕褐色顆粒；整合素V3主要在子宮內(nèi)膜腔上皮及腺上皮中表達(dá)，在細(xì)胞質(zhì)中可見到褐色顆粒。電鏡掃描發(fā)現(xiàn)，所有患者子宮內(nèi)膜樣本中均有胞飲突的陽(yáng)性表達(dá)。胞飲突主要表達(dá)于面向上皮細(xì)胞的頂端膜的表面，尤其是在凹陷部位的表達(dá)更為豐富，胞飲突呈現(xiàn)單個(gè)花蕾狀，胞飲突之間隔有單纖毛細(xì)胞。

本研究結(jié)果中觀察組患者妊娠率及活產(chǎn)率分別為48.67%及44.00%，明顯高于對(duì)照組。這一結(jié)果表明，輕刮術(shù)對(duì)于反復(fù)妊娠失敗者妊娠結(jié)局改善具有明顯促進(jìn)作用。兩組患者中妊娠者與非妊娠者子宮內(nèi)膜中OPN、LIF、整合素V3及胞飲突表達(dá)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，妊娠者子宮內(nèi)膜中4項(xiàng)因子表達(dá)均明顯高于非妊娠者，以上4項(xiàng)檢測(cè)因子表達(dá)水平高預(yù)示著子宮內(nèi)膜容受性良好，其與胚胎著床率及臨床妊娠率具有密切關(guān)聯(lián)性。