核轉錄因子-κB通路在BQ-123與單肺通氣預處理兔肺損傷中的作用

徐家行 陳寶鈞 劉勇 張亞楠 殷桂林

1華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院胸外科（武漢430014）；2中國人民解放軍中部戰區總醫院心胸外科（武漢430070）

單肺通氣指利用人工管道置入患者或實驗動物的氣管及支氣管內，主動將左、右主氣管進行隔離，使患側或實驗側肺組織不通氣而萎陷，只使健側或非實驗側的肺進行通氣的方法。這種通氣方式是胸外科手術中為獲得更大的手術操作空間及更好的手術視野的一種特殊的呼吸模式[1]。但與此同時，大量實驗及臨床相關資料表明，在進行單肺通氣后，隨著未通氣側肺泡組織的萎陷，因其組織形態及血流動力學的相應改變從而導致未通氣側肺組織發生損傷，其損傷程度與單肺通氣時間呈正相關[2-4]。

在減輕單肺通氣所致肺損傷的研究中，對肺組織進行預處理較為常見，相關的預處理包括藥物預處理和單肺通氣預處理[5]。藥物預處理是指在單肺通氣前進行藥物提前干預，其中BQ-123是目前在缺血-再灌注領域研究中較熱門的一種藥物。BQ-123是一種內皮素-1（endothelin-1，ET-1）受體拮抗劑，理論上其可以通過阻斷血管內皮素受體而對肺組織起到保護作用[6-8]。預處理在干預缺血再灌注損傷中研究較多，多采用5 min阻斷5 min開放的模式進行干預[9]。劉文雄等[10]觀察到在肺癌患者開始手術前將患側肺進行單肺-雙肺通氣各5 min 3次后，患者肺損傷相關指標有所好轉。筆者受到啟發后決定對兔使用單肺通氣預處理，在單肺通氣開始前對實驗兔進行單肺通氣-雙肺通氣各5 min 3次循環提前干預，其目的是使萎陷側肺組織對其后的單肺通氣進行預適應，以期于減輕單肺通氣時肺組織損傷的程度。但是目前關于單肺通氣所致肺損傷的研究中，與BQ-123及單肺通氣預處理相關的研究較少，而且針對于兩者產生相關作用的信號通路研究更是尚無定論。考慮到核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路是典型的炎癥信號轉導通路，在調控多種炎癥因子發揮重要作用[11-12]，本研究擬通過實驗探討BQ-123聯合單肺通氣預處理對單肺通氣肺損傷保護作用及進一步揭示其與NF-κB信號通路的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗主要器材及主要試劑多功能實驗動物呼吸機（EMC2002，北京），3.0帶氣囊氣管插管導管（COVIDIEN Ⅱc，美國），Tunel試劑盒（Roche），General ET ELISA Ki（elkbiotech），Rabbit TNF-α ELISA Kit（優爾生），Rabbit caspase-3 Elisa kit（elkbiotech），SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（ASPEN），BCA蛋白質濃度測定試劑盒（ASPEN），ECL化學發光檢測試劑盒（ASPEN），Protease Inhibitor Cocktail（Roche）。

1.2 動物及分組本實驗所采用實驗動物為日本大耳白兔，由武漢市萬千佳興生物科技有限公司提供，15只健康清潔級日本大耳白兔（實驗動物許可證號：SCXK（鄂）2016-0011），體質量（2.5± 0.3）kg，性別不拘。大耳白兔飼養于醫院實驗動物房，單籠喂養，調整室內溫度為22～25℃，濕度50%～60%，人工12 h/12 h晝夜周期，自由飲食水。隨機對其分為3組進行實驗（n=5）：O組，通氣條件為單肺通氣2 h，雙肺通氣0.5 h。OP組，行單肺通氣前予以靜脈注射 BQ-123 50 μg/kg[1]，通氣條件同O組。BP組，在給予BQ-123前肺通氣預處理（單肺5 min，雙肺5 min）× 3，通氣總時間同O組[9]。

1.3 實驗動物模型的建立常規術前禁食、禁水，從兔左側耳緣靜脈注射10%水合氯醛注射液（2 mL/kg）進行麻醉，間斷予以推注肌松劑阿曲庫銨0.1 mg/kg及每40 min靜脈推注10%水合氯醛2 mL維持麻醉。常規術區皮膚去毛、消毒，游離右側頸靜脈并放置24 G留置針建立靜脈通路，同法游離左側股動脈并置24 G留置針，外接心電監護儀動脈壓力模塊用于監測實驗兔動脈有創血壓情況。甲狀軟骨下第3個氣管環處“T”型切開氣管，插入帶氣管插管導管，連接呼吸機。雙肺通氣時小動物呼吸機參數設置如下：呼吸頻率設置為35次/min，潮氣量設置為10 mL/kg，吸呼比設置為1∶1，吸入氧濃度設置為100%。單肺通氣時小動物呼吸機參數調整為：呼吸頻率設置為40次/min，潮氣量設置為8 mL/kg，其余參數同前，并實驗中檢測兔動脈血氣分析，根據其監測的動脈血氣分析結果調整小動物呼吸機參數。單肺通氣時在兔左側胸壁外側第6肋間切開長約1 cm觀察左肺萎陷情況，直視下見左側肺組織由膨脹變為完全萎陷可作為左側單肺通氣模型建立成功。實驗過程中室溫維持在（26±2）℃，實驗中監測兔肛溫[13]。

1.4 ELISA法檢測兔肺組織中ET-1、腫瘤壞死因子-α（tumornecrosis factor-α，TNF-α）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3含量 實驗動物在實驗結束后通過快速放血法處死，留取左下肺組織大小約1 cm×1 cm×0.3 cm，用生理鹽水反復沖洗去除殘留血液，將肺組織剪碎并進行勻漿，取其上清液，根據ELISA試劑盒上的說明書步驟進行操作，使用雙抗體夾心ELISA法測肺組織中的ET-1、炎癥相關因子（TNF-α）、凋亡相關因子（caspase-3）。

1.5 采用TUNEL法計算細胞凋亡指數（apoptoticindex，AI） 取另外一塊同等大小兔左下肺組織，生理鹽水沖洗后10%甲醛溶液進行固定，制成切片保存。取2 μm切片脫蠟并進行水化，PBS溶液沖洗后用蛋白酶K室溫下消化，再用PBS溶液沖洗3次，根據TUNEL試劑盒上面的說明書步驟進行操作。染色后每張玻片在400倍光學顯微鏡下隨機選取5個視野進行觀察，分別記錄視野中細胞核上染有棕黃色顆粒物質的細胞及細胞總數，根據公式：AI=陽性細胞/細胞總數×100%，對統計值取平均值[14-15]。

1.6 采用Westernblot法測定兔左下肺組織中NF-κBp65及IκBα蛋白表達水平 取同等大小兔左下肺組織標本，予以PBS溶液沖洗去除殘血，剪成小碎塊后加入組織裂解液，勻漿提取肺組織中的總蛋白，以BCA蛋白質濃度測定試劑盒測定實驗樣品蛋白濃度。使用SDS-PAGE法將組織樣品經行電泳，蛋白凝膠電泳檢測組織中NF-κBp65及IκBα蛋白表達水平，以β-Actin為內對照，將膠片進行掃描存檔，圖像經過AlphaEaseFC軟件處理系統分析目標帶的光密度值，計算NF-κBp65及IκBα蛋白條帶與β-Actin蛋白像素灰度值比值作為蛋白表達相對水平[16]。

1.7 統計學方法采用SPSS 22.0統計學軟件對實驗所得數據進行統計學分析，實驗數據中計量資料以均數±標準差進行表示，組間整體比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ET-1、TNF-α及caspase-3的含量O組、OP組和BP組之間進行比較，左下肺組織中ET-1、炎癥因子TNF-α及促凋亡關鍵因子caspase-3含量O組最高，OP組較O組下降，但高于BP組，3組之間差異有統計學意義。但OP組與BP組間進行比較，兩者之間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各肺組織中ET-1、TNF-α及caspase-3的水平比較Tab.1 Comparison of level of ET-1，TNF-α and caspase-3 in the lung tissue of each group（n=5） ± s，pg/mL

表1 各肺組織中ET-1、TNF-α及caspase-3的水平比較Tab.1 Comparison of level of ET-1，TNF-α and caspase-3 in the lung tissue of each group（n=5） ± s，pg/mL

注：標有相同字母表示組間差異無統計學意義（P＞0.05）；標有不同字母表示組間差異有統計學意義（P＜0.05）

組別O組OP組BP組F值P值ET-1 153.21±14.20a 128.33±19.48b 113.46±16.74b 7.024 0.010 TNF-α 27.30±3.35a 21.78±2.37b 18.12±2.30b 14.500 0.001 caspase-3 43.96±5.76a 34.22±3.95b 31.56±5.87b 7.678 0.007

2.2 肺組織中細胞凋亡率的變化在400倍顯微鏡下觀察，經TUNEL染色后凋亡細胞的核呈棕黃色或深褐色。通過公式計算AI指數，O組最高，OP組較O組下降，但高于BP組。但通過兩兩之間比較，在OB組、BP組兩者之間的差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 Westernblot實驗測定3組兔單肺通氣肺組織中NF-κBp65及IκBα蛋白表達 OP組和BP組左下肺組織NF-κBp65表達水平顯著下調，NF-κBp65與內參β-actin的灰度比值分別為OB組、BP組，均顯著低于O組，其中BP組最低，3組之間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。但在OB組、BP組兩者之間比較，兩者之間的差異無統計學意義（P＞0.05）。OP組和BP組左側肺組織IκBα表達水平顯著上調，IκBα與內參β-actin的灰度比值分別為OB組、BP組，均顯著高于O組，其中BP組最高，3組之間比較差異有統計學意義。同樣在OB組、BP組兩者之間比較，兩者之間的差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1、表3。

表2 各組兔肺組織中AI的比較Tab.2 Comparison of AI in the lung tissue of rabbits of each group（n=5） ±± s

表2 各組兔肺組織中AI的比較Tab.2 Comparison of AI in the lung tissue of rabbits of each group（n=5） ±± s

注：標有相同字母表示組間差異無統計學意義（P＞0.05）；標有不同字母表示組間差異有統計學意義（P＜0.05）

組別O組OP組BP組F值P值AI 33.52±3.79a 25.13±6.53b 23.22±4.62b 5.752 0.018

圖1 Western blot法肺組織中NF-κBp65及IκBα蛋白表達Fig.1 Expression of NF-κBp65 and IκBαprotein in lung tissue with Western blot

表3 各組兔肺組織中NF-κBp65及IκBα蛋白表達水平比較Tab.3 Comparison of NF-κBp65 and IκBα protein in lung tissue of each group（n=5）±s

表3 各組兔肺組織中NF-κBp65及IκBα蛋白表達水平比較Tab.3 Comparison of NF-κBp65 and IκBα protein in lung tissue of each group（n=5）±s

注：標有相同字母表示組間差異無統計學意義（P＞0.05）；標有不同字母表示組間差異有統計學意義（P＜0.05）

組別O組OP組BP組F值P值NF-κBP65 0.60±0.09a 0.43±0.05b 0.39±0.06b 13.166 0.001 IκBα 0.12±0.08a 0.60±0.15b 0.64±0.12b 29.153＜0.001

3 討論

單肺通氣過程中，肺組織萎陷時，由于失去肺泡表面張力，肺組織出現不同程度損傷[17]。單肺通氣所致肺損傷的本質是單肺通氣時機械性因素通過相關信號通路導致肺組織產生炎癥反應，其基本表現是炎癥反應。其中，ET-1為目前研究較多的一種肺損傷相關的重要因子[18]，其主要通過與其受體結合而實現作用，除收縮血管外，其還有致血管內皮細胞纖維化，促進活性氧生成并參加氧化應激反應。肺組織內血管豐富，既有肺循環的肺動靜脈亦有體循環的支氣管動靜脈，ET-1含量豐富[19]。本實驗中兔進行單肺通氣，因肺泡萎陷造成肺泡表面張力以及肺內血管含氧量的改變，從而導致單肺組織內血管形態及血流的改變。因而發生肺損傷的組織中，與血管損傷相關的ET-1含量亦會與損傷程度有關。而本實驗不僅對單肺通氣肺組織中ET-1含量進行測定，而且實驗中使用ET-1受體拮抗劑BQ-123進行干預，其主要目的是通過抗ET-1收縮血管效應，降低毛細血管通透性并減少炎癥細胞聚集從而對組織起到保護作用。反映單肺通氣后肺損傷嚴重程度的炎癥因子中，TNF-α是目前研究較多的一種[20]。其主要為單核-巨噬細胞分泌的早期炎癥遞質，可引發炎性級聯反應，是炎癥反應程度的關鍵一環其水平的高低可反應組織損傷的嚴重程度，是有效衡量應激反應的指標。通過本實驗相關數據表明OP組和BP兩組肺組織中ET-1及TNF-α含量較O組均明顯減少，且在BP組中下降更為明顯，差異有統計學意義，從而可以進一步推論得出，3組實驗動物中，肺組織損傷程度依次下降。

肺損傷的過程中會出現肺組織細胞凋亡，細胞凋亡導致的肺組織細胞丟失可導致肺功能受損，發生細胞凋亡越嚴重的肺組織內，其肺損傷越嚴重。細胞凋亡的主要途徑是死亡受體通路和線粒體通路，兩條通路最終都通過激活caspase-3執行凋亡[20]，因而，本實驗擬通過測量不同條件下肺組織caspase-3的含量，從而對單肺通氣后肺損傷程度進行評定。結果顯示，OP組和BP組中促進凋亡的caspase-3蛋白表達較O組中明顯降低，且BP組降低更加明顯，進一步提示肺通氣預處理和BQ123減輕了兔單肺通氣后肺細胞凋亡。本研究發現，TUNEL染色顯示肺泡及血管內皮細胞呈現凋亡現象，提示細胞凋亡參與了肺損傷。進一步分析凋亡指數，OP組和BP組中的AI較O組中明顯降低，且BP組降低更加明顯，這與肺組織caspase-3的含量相一致。

NF-κB信號通路是一種細胞核轉錄因子，其中以p50和p65二聚體的形式最為常見，并可與抑制因子IκB結合。NF-κB信號通路是典型的炎癥信號轉導通路，NF-κB調控一大類基因的表達，其調控的靶基因包括細胞因子（如TNFα）等，并在調控細胞凋亡、炎癥反應等方面發揮重要作用[22-23]。本研究結果顯示：O 組肺組織中 NF-κB p65蛋白表達明顯升高，IκB蛋白表達降低明顯，與OB組及BP組相比，差異具有統計學意義（P＜0.05）。NF-κB p65蛋白表達與上文中所提及的ET-1、TNF-α、caspase-3以及 AI呈現出正相關，IκB蛋白表達與上文中所提及的ET-1、TNF-α、caspase-3以及AI呈現出負相關。表明在實驗過程中，BQ-123和單肺通氣預處理上調了單肺通氣肺組織IκB蛋白表達，通過NF-κB信號通路，抑制了單肺通氣肺損傷過程中相關的炎癥反應與細胞凋亡。

本實驗中，先使用ET-1受體拮抗劑BQ-123進行預處理干預，觀察其在單肺通氣肺損傷中的相關作用，并在此基礎上進一步采用單肺通氣-雙肺通氣各5 min 3個周期循環進行預處理，已期于肺組織提前對單肺通氣進行適應，從而進一步減輕單肺通氣時對肺組織的損傷程度。但是，在實驗過程中觀察，雖然3組之間差異有統計學意義，但OP組及BP組兩組之間進行比較，兩者之間差異并不大，分析其可能存在的原因是單肺通氣預處理的對肺損傷保護作用相對BQ-123的預處理較弱，兩者之間相互疊加作用不明顯。

綜上所述，經過BQ-123進行干預處理后，兔單肺通氣肺損傷明顯減輕，在此基礎上予以單肺通氣預處理，兔單肺通氣肺損傷得以進一步減輕；相關數據表明，NF-κB信號通路可能在兔單肺通氣肺損傷的發生與發展中起到了關鍵的作用。