多功能性納米膠囊用于胃癌靶向磁共振成像和體內光動力治療

張玉會 張倩 章阿敏 潘少君 洪立新 何井華

1南方醫科大學珠江醫院（廣州510280）；2上海交通大學電子信息與電氣工程學院儀器科學與工程系，上海智能診療儀器工程技術研究中心（上海200000）

近幾十年來，癌癥的患病例數和病死例數一直保持上升趨勢。其中，胃癌的患病率和病死率在全球惡性腫瘤中高居前五[1-2]。目前，胃癌的標準診斷和治療方法都會對身體造成不同程度的損傷。并且由于早期胃癌的臨床癥狀不典型，故大多數患者確診時已經失去了治療機會。所以要想顯著提高診斷和治療效果，需要找到更優良的、損傷更小的方法。

納米技術與光敏劑用于腫瘤的診斷與治療的技術取得了較大突破，如腫瘤靶向給藥，MRI造影劑，基因治療等[3-5]。但是由于納米粒子和光敏劑具有較低的水溶性，納米粒子在常溫下易團聚等問題[6-8]，導致大多數技術的發展受到了限制。近幾年來，多功能納米膠囊的研究引起了廣泛的關注。多功能納米膠囊是利用高分子形成囊泡，包載一種或多種納米粒子形成直徑極小的納米膠囊。它具有許多優點，如：增加納米團簇的穩定性以避免其長大；保護內核免受環境的破壞；促進納米顆粒在不同介質中的分散性；可包載多種物質；增加物質的活性等[9]；利用納米膠囊的這些優點，本研究采用微乳液法共同負載磁性納米粒子及光敏劑，制備出集診斷與治療為一體的多功能納米膠囊。本研究將對這種膠囊的生物學應用的可行性做出評價。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞健康的雌性BALB/c裸鼠，體質量（20±3）g，來自于實驗中心（中國上海）。人胃癌細胞株MGC-803細胞，來自于中國科學研究院上海細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器乙酰丙酮鐵（Ⅲ）（Fe（acac）3）、乙酰丙酮鈷（Ⅱ）（Co（acac）2）、乙酰丙酮錳（Ⅱ）（Mn（acac）2）、油酸（OLA）、油胺（OLAM）、二苯醚、苯甲醚、十二胺（DOCA）購于阿拉丁；1，2-十六烷二醇、聚乙烯醇（PVA）和聚（異丁烯-鋁-馬來酸酐）（PMA）購于Sigma-Aldrich；葉酸、Chlorin e6（Ce 6）、乙醇、二氯甲烷、四氫呋喃（THF）和氯仿（（CHCl3）、二甲基亞砜（DMSO）購買于國藥集團化學試劑有限公司；DMEM高糖培養基購自Hyclone公司；新生牛血清（NBS）購自Gibco公司；MTT及4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液購自Sigma公司；紫外分光光度計購自美國Agilent公司；熒光分光光度計Hitachi FL-4600來自日本日立公司；X射線衍射儀（D8 ADVANCE）購于德國Bruker公司；紅外線光譜儀（Nicolet6700）購于美國賽默飛世爾殼公司；掃描電子顯微鏡、生物型透射電鏡、場發射透射電鏡（SEM、TEM、HRTEM）購自美國FEI公司；電位和粒度分析儀（NICOMP 380ZLS）購于美國PSS公司；酶標儀購自美國Thermo Fisher公司；FV500-IX70型激光共聚焦顯微鏡購自德國Leica公司；FACS calibur型流式細胞儀購自美國BD公司；小動物活體熒光成像儀（In-Vivo F PRO）來自美國Bruker公司；磁共振成像儀（1.5T）來自上海紐邁國產活體成像系統。

1.3 CoFe2O4@MnFe2O4的合成方法單分散的CoFe2O4@MnFe2O4是一種核殼結構，MnFe2O4作為外殼，其內包含CoFe2O4而形成核殼結構。CoFe2O4粒子的合成是采用乙酰丙酮鐵、乙酰丙酮鈷、油酸、油胺、1，2-十六烷二醇和二苯醚通過高溫熱分解法合成。經過乙醇清洗、離心，最后分散在己烷中，得到20 mg/mL 的樣品[10]。CoFe2O4@MnFe2O4是通過種子法合成。CoFe2O4作為種子被加入到乙酰丙酮鐵、乙酰丙酮錳、油酸、油胺、1，2-十六烷二醇和苯甲醚的混合物當中，經逐步加熱后得到黑色沉淀。所得黑色沉淀通過上述方法清洗后分散在CHCl3中，即為 CoFe2O4@MnFe2O4。

1.4 多功能納米膠囊的合成多功能納米膠囊的合成以PMA作為雙親性大分子，通過微乳液法負載疏水性的Co@Mn MNPs與Ce6，實現納米膠囊在水相中的穩定性。PMA的合成方法參考已報道的文獻[11-12]。納米膠囊的合成方法如下：將610 μL的氯仿、280 mL的PMA（0.7 mg/mL）與600 μL的Ce6（2.5 mg/mL）混合在15 mL離心管中，放入水浴鍋超聲10 min，并逐滴加入 80 μL 的CoFe2O4@MnFe2O4。隨后，將該溶液滴入到2 mL的PVA溶液中，水浴超聲10 min。將得到的乳液置于細胞粉粹機中繼續超聲20 min（50 W，10 s/10 s），使Co@Mn MNPs和Ce6與PMA的疏水性側鏈一起被包裹，留下親水骨架將羧基置于MNCPs表面，穩定溶在水中。最后，加入1 mL冰水，旋蒸5～6 min，蒸發掉殘余的氯仿。將得到的產物通過離心（10 min，5 000 r/min），去除上層清液。取出下面的沉淀分散在500 μL的蒸餾水中。反復清洗三次，完全除去多余的乳液。最后分散在3 mL的蒸餾水中，成功得到負載了Co@Mn MNPs和Ce6的納米膠囊。用葉酸對納米膠囊表面進一步修飾能提高胃癌腫瘤的靶向性。在樣品中加入10 mg分散在SBB 9.0緩沖液的活化葉酸，靜置一晚。對得到混合物進行離心清洗（5 000 r/min，10 min）。最后制成了具有靶向性的MNCPs，并將其保存在4℃，以供進一步使用。

1.5 細胞培養MGC-803細胞培養在含有10%的小牛血清與500 μL的抗生素的培養基中，置于37℃與5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。共聚焦顯微鏡與流式細胞儀下觀察細胞的攝取及細胞的MTT實驗方法參考文獻[13]。

1.6 納米膠囊在小鼠體內的分布將胃癌MGC-803腫瘤細胞（10×105個）注射入裸鼠右腿皮下，當腫瘤體積約為100 mm3時，表明胃癌負荷瘤裸鼠模型成功建立。利用小動物成像儀，采集MNCPs中Ce6的熒光信號，研究MNCPs在小鼠體內的分布。將相同量的MNCPs與游離Ce6（Ce6含量：2.5 mg/kg）經尾靜脈注射到帶有腫瘤的小鼠體內。將這些老鼠麻醉，實時監測（注射前、注射后2 h、4 h、8 h、12 h和24 h）小鼠體內的熒光分布，這一過程主要記錄重要臟器和腫瘤部位。根據獲得的活體圖像，利用動物成像軟件分析并獲得熒光強度值。

1.7 多功能納米膠囊在體內的光動力治療利用上述方法建立胃癌負荷瘤裸鼠模型。經尾靜脈將MNCPs和游離Ce6（Ce6含量：2.5 mg/kg）注射到小鼠體內。24 h之后，激光照射腫瘤部位30 min（50 mW）。實時測量腫瘤的最大和最小直徑。腫瘤體積公式計算V=a×b2×1/2，其中a和b分別表示腫瘤的最大長度和最小寬度。記錄腫瘤體積變化到18天，并觀察小鼠體質量及腫瘤變化情況。

1.8 磁性納米粒子在小鼠體內的磁共振成像經尾靜脈將MNCPs和游離Co@Mn MNPs（0.5 mg/mL）注射到胃癌負荷瘤裸鼠體內。之后對小鼠進行麻醉，測量T2低磁場（1.5 t）作用下的信號值，并記錄間隔不同時間（注射前、注射后2 h、4 h、6h和8 h）的MRI圖像。

2 結果

2.1 多功能納米膠囊的表征使用掃描電鏡和透射電鏡觀察納米膠囊的形貌，如圖1所示，MNCPs呈高分散的球形，粒徑大小約（150±15）nm，并且能清楚地觀察到膠囊內包含較多的黑色粒子如圖1。使用粒徑儀檢測MNCPs的水合粒徑，如圖2A所示，MNCPs的水合粒徑約（160±11.23）nm。為了觀察MNCPs的穩定性，本研究連續20多天監測了MNCPs的粒徑變化。如圖2B，MNCPs的粒徑大小無明顯變化。通過微乳相法將Ce6包裹在PMA中，Ce6穩定存在于PMA內部，故可利用熒光分光光度計測得MNCPs的熒光光譜，如圖2C示，MNCPs在激發波長665 nm處有明顯的熒光。為了探測MNCPs表面電荷情況，本研究使用zeta（ζ）電位儀測出了MNCPs的ζ電位。如圖2D所示，Co@Mn MNPs，Co@Mn-PMA MNPs，Co@Mn-PMA-Ce6 MNPs和MNCPs的ζ電位值分別為0 mV、-22.3 mV、-16.5 mV和-29.3 mV。紅外線光譜儀測得FTIR圖譜如圖3A所示，分別在1 638 cm-1、1 569 cm-1、2 870 cm-1、2 926 cm-1和1 045 cm-1處有明顯的特征性吸收峰。利用X射線衍射圖譜譜儀測得XRD圖譜如圖3B所示，吸收峰分別位于（111）、（220）、（311）、（422）、（511）、（440）和（553）處。用紫外分光光度計測得游離Ce6、葉酸、Co@Mn MNPs、Co@Mn MNPs-Ce6和MNCPs的紫外光譜如圖3C所示，圖中游離Ce6和葉酸分別在665 nm和280 nm處有一個明顯的特征吸收峰。并且在Co@Mn-PMA-Ce6 MNPs和MNCPs的光譜中也能觀察到與Ce6一致的吸收峰。在MNCPs光譜中觀察還能到在280 nm處有一個不明顯的吸收峰，與葉酸的吸收峰一致。測得Ce6的標準曲線見圖3D、E所示，該曲線中各點均勻地分散在曲線的兩側。

圖1 MNCPs的形貌表征Fig.1 Morphological characterization of MNCPs

圖2 多功能納米膠囊的表征Fig.2 Characterization of MNCPs

圖3 MNCPs的合成說明圖Fig.3 The illustration of MNCPs synthesis

2.2 共聚焦顯微鏡與流式細胞儀研究腫瘤細胞對MNCPs的攝取作用在激發光的照射下，腫瘤細胞核被DAPI（λEx=405nm，λEm=440～470nm）染色液染成藍色，而 MNCPs中的 Ce6（λEx=633 nm，λEm=700nm）在激發波長下發出紅色熒光。因此，可以通過觀察腫瘤細胞內的兩種熒光強弱來比較MNCPs的攝取量。從圖4A中可以觀察到，隨著培養時間的延長，細胞內的紅色和藍色熒光信號均逐漸增強。本研究還利用流式細胞FL3-H通道收集了不同時間點的細胞熒光信號。發現隨著時間的延長，細胞的熒光值也逐漸增加。為了證實MNCPs被腫瘤細胞攝取，本研究研究了細胞的TEM，見圖4B、C，溶酶體中分布著許多具有完整球形結構的MNCPs（紅色箭頭），有的從破裂的MNCPs中釋放出大量穩定的單分散Co@Mn MNPs。

2.3 MTT法檢測MNCPs對腫瘤細胞的暗毒性和光毒性見圖5A，當MNCPs的濃度逐漸增加時，腫瘤細胞存活率無明顯降低。相反，用相同濃度的游離Ce6作為對照組時細胞存活率逐步降低。MNCPs與Ce6的光毒性見圖5B，在 633nm He-Ne激光器照射下，隨著MNCPs與Ce6的濃度增加，MNCPs組有大量細胞壞死和凋亡。而Ce6組的細胞壞死和凋亡數量相對MNCPs較少。

2.4 多功能納米膠囊在小鼠體內的分布本研究采用小動物熒光成像技術對多功能納米膠囊在小鼠體內的分布進行了研究。見圖6A，尾靜脈注射MNCPs和游離Ce6至2 h后，兩組小鼠全身熒光迅速增強。對于游離Ce6組，4 h后熒光信號迅速減弱，到24 h時，腫瘤部位基本無熒光信號存在。然而，對于MNCPs組，在注射24 h之后，全身的熒光信號仍然很明顯存在，腫瘤部位的熒光信號仍然保持很強。圖6B為不同時間點小鼠腫瘤部位的平均熒光強度。從圖中可以看出，隨著時間的延長MNCPs仍保持較強的熒光信號。圖6C為注射藥物3天后各器官的熒光強度，從圖中可以看到，MNCPs在腫瘤部位仍有較強的熒光信號。

2.5 多功能納米膠囊的光動力治療MNCPs的治療效果是通過評價光動力療法治療18 d內腫瘤體積的變化來獲得的。如圖7A、B所示，與游離Ce6組相比，MNCPs組腫瘤明顯受到抑制，腫瘤生長速度很慢。相反，用游離Ce6處理的荷瘤裸鼠的腫瘤并沒有受到抑制，一直處于快速增長狀態。為了觀察膠囊在體內的毒性，本研究觀察了小鼠光動力療后體質量的變化。從圖7C可以看出，任何一組中小鼠體質量變化都不明顯。此外，體內主要的代謝途徑包括腎臟代謝和肝臟代謝。可以通過評估體內器官的損傷程度來判斷藥物的毒性。見圖7D，MNCPs的H＆E染色未顯示明顯異常或病變。

圖4 細胞對MNCPs的攝取Fig.4 Cellular uptake assay of MNCPs

圖5 MNCPs的暗毒性與光毒性Fig.5 The dark toxicity and phototoxicity of MNCPs

2.6 磁性納米粒子在小鼠體內磁共振成像為了研究MNCPs在體內的磁共振成像效果，將等量的MNCPs和Co@Mn MNPs通過尾靜脈注射到老鼠體內，實時記錄腫瘤區域的變化情況。見圖8，MNCPs和游離Co@Mn MNPs處理的小鼠在腫瘤部位均變黑，在注射后4 h后最明顯，且MNCPs比Co@Mn MNPs組更暗。

3 討論

本研究使用微乳液法設計了新型MNCPs，其由疏水性Co@Mn MNP、光敏劑Ce6和兩親性聚合物組成，并進一步與胃癌靶向分子葉酸共價偶聯。收集的MNCPs具有約（150±15）nm的平均直徑，具有平滑的球形結構和高度均勻的尺寸。對比JCPDS NO.74-2403 和 JCPDS NO.22-1086 卡片[14]，能夠證明膠囊內成功地負載了納米粒子。而葉酸通過氨基鍵與PMA的羧基鍵形成酰胺鍵，故MNCPs在紅外光譜1 569 cm-1處出現的酰胺鍵吸收峰說明了葉酸已成功偶聯在PMA上[15],并且在常溫下能夠長期保存。

圖6 小鼠體內的熒光成像Fig.6 In vivo the fluorescence imaging of mice

在細胞實驗中，本研究表明隨著時間的延長，細胞對MNCPs的攝取量逐漸增加。進入細胞溶酶體中的MNCPs結構被破壞，并成功的釋放出Ce6和Co@Mn MNPs。這可能是由于MNCPs的直徑極小，細胞可以利用內吞的方式將MNCPs吞入細胞中。當MNCPs到達細胞溶酶體的酸性環境中時，PMA表面的羧基鍵與H+結合，導致囊泡結構破壞釋放出Co@Mn MNPs及光敏劑。與之前的研究相比[16]，本研究的MNCPs將Ce6包裹在屏蔽層中使其能保持單分子結構而不聚集，能在酸性環境中持續釋放。

對于體內光動力治療，MNCPs表現出突出的光動力性能。在激光照射條件下，MNCPs能顯著地抑制腫瘤的生長速度。其原因可能是MNCPs能靶向到達腫瘤部位，并在腫瘤組織中長期富集。當在633 nm激光照射下時，處在腫瘤酸性環境中的Ce6可以被不斷地釋放，并產生單線態氧誘發腫瘤細胞凋亡和組織損傷。從而實現高效光動力治療，并作為熒光標記跟蹤藥物在動物體內的分布[17]。相反，游離Ce6在小鼠體內迅速代謝。使產生的單線態氧不足以抑制腫瘤的生長[18]。此外，體內主要的代謝途徑包括腎臟和肝臟代謝。藥物的毒性可以通過評估身體器官的損傷程度來評估。MNCPs組病理染色未見明顯異常，說明MNCPs的對體內臟器的毒性小。同時，由于MNCPs的腫瘤靶向性和富集性。故到達腫瘤部位的MNCPs作為T2造影劑在MRI中顯示出比游離的Co@Mn MNPs更有利的MR信號值。這種作用可能是由于小粒子（直徑＜200 nm）的相互作用，使水質子去相位在超順磁性納米粒子磁場中變得更加有效[19]。

綜上所述，MNCPs在MGC-803荷瘤小鼠模型中表現出良好的血液循環，生物相容性，抗降解性，低細胞毒性，高靶向選擇性，有效的腫瘤富集，高效光動力效果和MR信號的增強等優點，這實現了雙模態成像和對胃癌的準確診斷和治療[20]。因此，本研究中納米膠囊的突出特性可為近期腫瘤成像和藥物輸送提供新的思路。然而，本研究中提到小尺寸的納米膠囊更有利于成像，但是目前要想設計出更小尺寸的納米膠囊還存在一定的困難。后續本研究將繼續探索設計出尺寸更小的納米膠囊，實現更優異的腫瘤診斷與治療效果。

圖7 小鼠體內的光動力治療圖Fig.7 The photodynomics therapy imaging of mice in vivo

圖8 小鼠體內的磁共振成像Fig.8 The MRI imaging of mice in vivo