解脲脲原體DNA檢測方法評價及人群感染情況調查

宗曾艷，熊 丹，湯花梅，王萌萌，孔凡虹，闞麗娟，張水蘭，張秀明安徽理工大學，安徽 淮南 3000；深圳市羅湖區人民醫院檢驗科，廣東 深圳 44030

解脲脲原體（UU）通常在泌尿生殖道內繁殖，與盆腔炎、產后感染、不孕不育、前列腺炎，胎膜早破、早產等疾病密切相關[1-3]，也是非淋菌性尿道炎的致病菌[4]。UU-DNA定量檢測，是早期感染診斷，抗病毒療效觀察的重要指標，其檢測陽性率高于傳統的培養法[5]。實時熒光定量PCR技術（qRT-PCR）是實時檢測和定量基因表達，以熒光化學物質檢測每次聚合酶鏈式反應循環后產物總量的方法[6]，更快速、簡便而適用于臨床核酸檢測。研究表明，PCR技術被認為是診斷支原體、衣原體感染的可靠方法[7]；有研究對常用的3種檢測方法進行比較后，也建議對于初篩標本應首選用qRT-PCR檢測方法[8]。

目前臨床上性能驗證主要集中在生化、免疫、臨檢等領域，分子生物學尚無完整權威的性能驗證方案[9]， 2019年 2月 15日 最 新 發 布 的 CNAS-GL039文件由中國合格評定國家認可委員會制定，是對CNAS-CL02:2012《醫學實驗室質量管理和能力認可準則在分子診斷鄰域的應用說明》中有關分子診斷相關檢驗程序進行性能驗證實驗所做的具體解釋和指導。因此，本研究參考以上文件對qRT-PCR方法檢測解脲脲原體核酸的性能進行評價，為檢驗科分子定量檢測方法的性能驗證提供參考，并分析2018年全年來我院就診患者UU感染情況，為UU感染的診斷和治療提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 樣本與儀器

所需標本為科室收集的臨床分泌物拭子標本，儲存于-20 ℃。收集2018年1～12月來我院就診患者檢測的UU結果（剔除給藥后復查結果），共22 468例。拭子標本均為各科專業人員使用醫用棉簽在女性宮頸口或男性尿道口1～2 cm處旋轉15 s后取出，放置在無菌試管中送檢。于上海之江生物有限公司采購的解脲脲原體核酸測定試劑盒，PCR擴增儀SLAN-96S，全自動核酸提取儀Autrax。所有操作步驟和結果判定按照試劑說明書進行。

1.2 方法

1.2.1 精密度評估 各儀器均在在控情況下，取2例UU-DNA陽性宮頸分泌物標本和1例陰性標本。各樣本每次5次重復，分4批次測定，各計20次重復，記錄每次檢測結果，以陰陽性判定，陽性結果以Ct值（達到閾值的最小循環數）作為評判標準，計算不精密度，要求變異度（CV）≤5%，陰性符合率均＞95%則符合要求。

1.2.2 準確度評估 取12例在本實驗室用UU-DNA核酸測定試劑盒檢測的宮頸分泌物樣本（其中陽性樣本10例，陰性樣本2例），與測序方法進行對比分析，分析結果的一致程度，陰陽性符合率＞95%，則準確度符合要求。

1.2.3 最低檢測下限評估 依據上海之江UU核酸試劑盒說明書和《感染性疾病個體化醫學分子檢測技術指南》，取1例UU-DNA擴增結果Ct值約等于35（濃度約在103copies/mL）樣本，進行10次擴增，記錄每次檢測結果。如為陽性，則記錄相應的Ct值，統計10次擴增結果，評判標準參考CLSI-MM17A文件關于檢測下限的標準可知，10次擴增結果總陽性率均＞95%則滿足要求。

1.2.4 抗干擾能力 （1）抗交叉反應評估：由之江公司提供的包含淋球菌、沙眼衣原體、人型支原體、生殖支原體、白色念珠菌和B組鏈球菌的質粒（濃度約5×106copies/mL），分別加入到10例UU-DNA陰性標本內，進行擴增，統計10例UU-DNA陰性標本的擴增結果，依據上海之江UU核酸試劑盒說明書和CNAS GL-039標準，要求10例標本結果總陰性符合率≥95%。（2）內源性干擾評估：取1份UU-DNA陽性樣本分成4份，各300 μL，每份標本加入正常人紅細胞0、6、10、12 μL的樣本進行提取，提取DNA后再進行復孔擴增，重復3次，要求均≤5%，并評判符合性。

1.3 UU感染情況調查

對2018年1～12月來我院門診和住院就診患者UU-DNA檢測結果進行統計分析。納入本研究中的臨床樣本數據，已征得本醫院倫理委員會的同意和批準。

1.4 統計學方法

采用Excel和SPSS24.0統計分析解脲脲原體陽性率及不同年齡段男性和女性感染情況，分析不同組別間差異使用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 方法評價

2.1.1 結果判定 質控在控情況下，判斷檢測樣本Ct值，結果顯示UNDET或＞40，報告為陰性結果；Ct值≤38，報告為陽性；Ct值38～40，則重復測定該樣本，如結果仍為38～40，且溶解曲線呈S型，則判斷為陽性，否則為陰性。計算最終擴增結果Ct值的均值、標準差及CV，要求CV小于允許總誤差5%。

2.1.2 重復性評價 2例陽性標本20次檢查結果Ct值分別為25.71±0.14、28.16±0.11，CV值為0.54%、0.39%，均小于允許CV值，陰性標本檢測結果均為陰性，符合率100%，驗證通過。

2.1.3 準確度驗證 選取12例（10例陽性，2例陰性）在本實驗室用核酸試劑盒qRT-PCR檢測宮頸分泌物樣本結果，經DNA擴增后（引物序列為CAATCTGCT CGTGAAGTATTA，ACGACGTCCATAAGCAACT），將產物進行測序，進行結果比對。陽性標本序列經Blast，同源序列100%，為解脲脲原體序列，表明準確度符合本實驗室要求。測序結果（圖1）。

2.1.4 最低檢測下限 測定結果顯示，UU標本進行10次擴增，Ct值均小于37，判斷為陽性，Ct均值36.26，結果偏倚為1.16%，小于允許CV值5%，檢測結果符合要求。

圖1 UU-DNA測序實驗凝膠電泳結果

2.1.5 抗交叉反應 10例陰性標本加入干擾物質后擴增結果均為陰性，符合率為100%（10/10）＞95%，與混合質粒無交叉反應，結果符合要求。

2.1.6 內源性干擾 加入不同濃度紅細胞后擴增樣本，檢測結果CV值均小于5%，表明不存在明顯的內源性干擾，驗證結果通過（表1）。

表1 內源性紅細胞實驗結果

2.2 解脲脲原體感染情況調查

對2018年所有來我院就診患者經剔除復診結果后的檢測結果進行統計，最后共納入22 468例標本，年齡11～80歲，男性882例，女性21 586例，總的UU檢出13 431例，陽性率為59.8%；其中男性陽性檢出率22.7%，女性61.3%，差異有統計學意義（χ2=525.613，P＜0.05，表2）。

表2 UU總感染情況

2.2.1 不同年齡組男性感染情況 本次研究男性882例，檢出率22.7%，以31～50歲就診人數最多，年齡組從小到大感染率分別為25.0%、25.1%、22.1%、14.9%，各年齡組檢出率差異無統計學意義（χ2=3.511，P＞0.05），30歲以下組陽性檢出率25.0%高于31～80歲組，差異無統計學意義（χ2=1.806，P＞0.05，表3）。

表3 不同年齡組男性UU-DNA檢測結果

2.2.2 不同年齡組女性感染情況 本研究女性患者標本21 586例，檢出率61.3%，以21～50歲就診人數最多，陽性率最高年齡組為11～20歲，陽性率69.6%，21～30歲陽性率次之，為63.9%（χ2=2.207，P＜0.05），較年輕組11～30歲陽性檢出率64.4%，高于31～80歲組58.0%（χ2=92.830，P＜0.05，表4）。

表4 不同年齡組女性UU-DNA檢測結果

3 討論

實時熒光定量PCR是實驗室基因表達分析和食品應用的首選方法，是將傳統的RT-PCR方法與熒光共振能量轉移現象相結合，利用熒光引物進行PCR，并且具有良好的敏感性和特異性、低污染風險和縮短人工時間等優點，使得實時熒光定量PCR技術成為替代傳統PCR的一個有吸引力的PCR方法[10-11]。現在已廣泛用于UU-DNA的檢測，因此需要充分了解該方法學性能。但多數研究對實時熒光定量PCR方法的性能驗證集中于乙肝核酸檢測[12-15]，也有部分研究對UU核酸檢測進行過性能驗證[16-17]。因此本研究對熒光PCR檢測UU-DNA進行性能評估。準確度使用測序結果為金標準，12例樣本陰陽性結果與測序結果100%吻合，精密度、內源性抗干擾能力CV值均小于5%,最低檢出限樣本結果Ct值均小于37，結果為陽性，此時平均偏移為1.16%，滿足要求，從而保證檢測結果的可靠性。

本研究中UU總感染13 431例（59.8%），高于我國其他省份的研究報道[18-20]，與北京地區2013～2016年研究結果相比[21]，本研究男性檢出率為22.7%，低于北京地區的31.8%；女性檢出率為61.3%，高于北京地區的52.5%，分析可能與不同地區經濟發展水平、調查人群、檢測方法等因素有關。本研究女性陽性率顯著高于男性，與其它研究結果一致[20, 22]，這可能是由于女性特殊生殖系統結構和內分泌激素不同造成的，女性生殖系統的弱酸性環境更適合生殖道病原體存活。本研究中30歲以下女性陽性率64.4%，與30歲以上年齡組具有顯著性差異，與部分研究較一致[23]，即陽性率年齡段主要集中在21～30歲，感染率呈現年輕化，與該人群性行為方式，激素水平變化，性知識缺乏等有關。另有研究表明，無癥狀體檢女性中支原體檢出率為2.2%[24]，提示應采取措施普及性傳播疾病知識，引導本地區女性預防感染，定期體檢，適當治療。男性30歲以下育齡組陽性率為25.0%，高于30～80歲組，目前進行UU檢查的育齡男性總體數量偏少，應加強對育齡男性尤其是存在不孕不育疾病的男性進行性疾病知識宣講，積極進行病原體感染篩查。雖然1988年中國就啟動了全國性傳播感染監測系統，以監測性傳播感染的規模及其趨勢，但UU感染率仍呈上升趨勢[21]，因此應引起大家的重視，避免忽視或者漏診，臨床科研應進行更多流行病學研究，努力降低UU感染率。

綜上所述，qRT-PCR檢測方法靈敏度高，重復性好，抗干擾力強，檢測下限符合要求，可滿足于臨床檢測；流行病學研究有助于了解深圳地區UU感染情況，從而為臨床對UU的干預，防治提供依據。