肝癌血清特異標志物Dickkopf-1核酸適體的篩選及其鑒定

何 雷，趙運旺，李保林，安曉剛燕山大學環境與化學工程學院，河北 秦皇島 066004；秦皇島市第一醫院，河北 秦皇島 066000；空軍軍醫大學西京醫院，陜西 西安 700

目前，原發性肝癌的發病率位列世界第5，且發病率在世界范圍內逐年上升[1]。近年來臨床治療手段有進步，但5年生存率極低，僅為3%～5%[2]。目前肝癌診斷主要依賴于影像學檢查，而血清腫瘤標志物檢測是唯一無創傷的檢測手段，但敏感性較低，特別是在早期HCC的檢測中僅為25%～65%[3-5]。因此，迫切需要尋找特異性更高、親和力更強的肝癌血清標志物，從而為肝癌的早期診斷提供新的分子生物學檢測手段。有研究發現了Dickkopf-1（DKK1），它是經典的Wnt信號通路分泌拮抗劑[6]。有研究在肝癌組織中發現DKK1表達水平是上調的，微陣列分析有預測早期或AFP陰性狀態肝癌的價值[7]。

核酸適體是通過指數富集配基系統進化技術（SELEX）篩選獲得[8-9]，即利用體外合成的隨機寡核苷酸文庫，經過多輪篩選，并結合PCR擴增技術，使其得到指數級富集，最終獲得高親和力、高特異性的核酸適體。核酸適體其自身能折疊成特定的空間結構與靶標分子特異性結合，常被稱為“化學抗體”[10-12]。與蛋白抗體相比，核酸適體具有特異性更高、親和力更強、穩定性好、免疫原性和毒性低、易于合成、化學修飾及穿透腫瘤組織等優點[13-15]。然而目前核酸適體在腫瘤學檢測方面仍處于研究階段[16]，目前研究未見報道DKK1核酸適體的篩選。本研究以DKK1為靶標蛋白分子，羧基化瓊脂磁珠為篩選介質，采用SELEX技術篩選DKK1的核酸適體，建立一種簡單、快速的基于核酸適體檢測腫瘤血清標志物DKK1的分析方法，也為靶向藥物治療研制提供一定的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

ssDNA文庫（88 nt，1.2 nmol）：5′-CTATAGCAAT GGTACGGTACTTCC（40 N）CAAAAGTGCACGCTA CTTTGCTAA-3′（N=A、G、T、C）；引物P7：5′-CT ATAGCAATGGTACGGTACTTCC-3′；引物P11：5′-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3′；引物P11：5′-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3′及Biotin-P11引物（上海生物工程有限公司）。羧基化瓊脂磁珠（普洛麥格生物技術有限公司）。DKK1抗原（2 mg/mL）、DKK2抗原（2 mg/mL）、DKK1-3抗原（2 mg/mL）（北京科衛有限公司）。1×PBS緩沖液（137 mmol NaCl，2.7 mmol KCl，6.5 mmol Na2HPO4，1.8 mmol NaH2PO4）。

1.2 消減SELEX技術篩選DKK1核酸適體

5 μg/mL DKK1與0.5 mL羧基化瓊脂磁珠于1 mL PBS緩沖液，37 ℃孵育1 h。磁分離收集DKK1-磁珠復合物于1.5 mL EP管中，PBS緩沖液洗3次，加入1 mL封閉液（1% BSA，10 μmol/L tRNA，0.05% tween-20溶于PBS），37 ℃孵育30 min。PBS緩沖液洗3次，制備獲得DKK1-磁珠復合物。按上述操作程序，分別制備獲得DKK2-磁珠復合物、DKK3-磁珠復合物、DKK4-磁珠復合物。DKK2-磁珠復合物結合3 mL初級ssDNA文庫（95 ℃，5 min；4 ℃，10 min；37 ℃，5 min），37 ℃孵育30 min。磁分離，未結合的ssDNA上清液與DKK3-磁珠復合物結合，37 ℃孵育30 min。磁分離，未結合的ssDNA上清液與DKK4-磁珠復合物結合，37 ℃孵育30 min。磁分離將未結合的ssDNA上清液加入到DKK1-磁珠復合物中，37 ℃孵育1 h。磁分離棄去未結合的ssDNA，PBS緩沖液洗3次，加入200 μL ddH2O，95 ℃加熱10 min分離與DKK1-磁珠復合物特異結合的ssDNA。回收的ssDNA文庫作為qPCR擴增的模板，鏈霉親和素磁珠法制備獲得次級ssDNA文庫。重復上述篩選步驟。

1.3 鏈霉親和素磁珠法制備次級ssDNA文庫

整個篩選過程中，PCR的控制特別關鍵。在PCR擴增過程中引入有生物素修飾的引物，通過對稱PCR擴增每一輪的次級ssDNA文庫獲得量較大的標記有生物素的dsDNA產物。dsDNA產物與300 μL鏈霉親和素磁珠，37 ℃孵育30 min，磁分離獲得biodsDNA-鏈霉親和素磁珠復合物。PBS緩沖液40 ℃水浴4 min，洗去非特異結合的dsDNA。95 ℃熱變性使雙鏈DNA解旋實現其分離。再對其進行磁分離，收集上清液即獲得次級ssDNA文庫。

1.4 ELASA法實時監測篩選進程

按照鏈霉親和素磁珠法制備次級ssDNA文庫的方法，利用生物素標記的引物擴增獲得標記有生物素的次級ssDNA文庫。分別取50 μL磁珠于4個1.5 mL EP管中，分別標記為“1+”、“1-”；“2-”、“3-”EP管分別與200 μL DKK1、DKK2、DKK3、DKK4，37 ℃孵育1 h；投入每輪生物素標記后的ssDNA文庫，37 ℃孵育30 min，1×Binding Buffer洗3次，然后加入1∶1000稀釋的HRP-labeled Streptavidin 37 ℃ 孵育 30 min，1×PBS（含1.5% Tween-20）洗3次，200 μL TMB顯色液，避光顯色15 min，50 μL 1 mol/L H2SO4終止反應，置于酶標儀測定A450 nm值。

1.5 高通量測序及數據分析

將第6輪篩選獲得的次級ssDNA文庫作為模板，經對稱PCR擴增獲得dsDNA產物，擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，對其質量進行鑒定。將dsDNA送至上海生工生物工程有限公司進行高通量測序。預計每個文庫測序得到約10 000條序列。

對高通量測序結果進行生物信息學分析。采用Clustal X軟件和DNAman軟件分析二代測序結果，拷貝數＞1 000的核酸適體的保守序列。采用mfold軟件（Version 3.2）分析核酸適體的二級結構。

1.6 SPR測定DKK1核酸適體結合解離常數（Kd）

3個候選核酸適體與DKK1的解離常數（Kd）通過表面等離子共振體（SPR）測定。HEPES緩沖液作為運行緩沖液，50 μg/mL DKK1溶解于500 μL 10 mmol/L乙酸銨緩沖液（pH 6.0）中，稀釋后的DKK1點在SPR芯片上于4 ℃過夜。將三個核酸適體稀釋至一系列濃度。自動按照運行程序用于樣品注射和再生的重復循環。監測核酸適體-DKK1復合物的結合和解離時間為300 s。通過使用動力學評估軟件計算核酸適體與DKK1的相互作用。

1.7 圓二光譜分析DKK1核酸適體結構

為進一步確定核酸適體可能的二級結構特征。將終濃度為5 μmol/L的核酸適體（Apt-5、Apt-26、Apt-28）溶于10 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.0，含有0.1 mol/L KCl）中。將樣品在90 ℃下加熱變性5 min，然后逐漸冷卻至室溫。將變性后的核酸適體加到比色皿中，通過JASCOJ-810分光偏振計從320～220 nm收集CD光譜。

2 結果

2.1 每輪ssDNA文庫的親和力測試

采用消減SELEX技術循環篩選，利用生物素-鏈霉親和素-辣根過氧化物酶系統檢測1～6輪ssDNA文庫與DKK1的親和力。結果顯示，親和力在1～5輪明顯上升，第5輪SELEX篩選以后達到飽和，因此在第6輪時終止篩選（圖1）。

2.2 DKK1核酸適體的篩選

以DKK1為靶標，DKK2、DKK3、DKK4為反篩選靶標，通過6輪消減SELEX篩選獲得飽和的次級ssDNA文庫。每一輪篩選過程中用的ssDNA文庫與DKK1的用量直接關系到篩選是否成功。為了獲得高特異性的核酸適體，隨著篩選輪數的增加，篩選的條件越來越苛刻，比如，投入的ssDNA文庫逐輪減少，磁珠的用量逐漸減少，孵育時間逐漸縮短，洗脫力度逐漸增強。第1～6輪次級文庫經對稱PCR擴增后的dsDNA產物經3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示第6輪擴增后的ssDNA次級文庫的條帶清晰，大小合適（88 bp），沒有任何雜帶（圖2），與初始ssDNA文庫片段大小吻合。

圖2 1～6輪ssDNA PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

2.3 高通量測序結果分析和二級結構預測結果

利用消減SELEX技術篩選核酸適體，通常對與靶標分子作用力達到飽和的核酸適體次級庫進行高通量測序。第6輪SELEX篩選獲得的次級ssDNA文庫，利用一對無任何修飾的P7、P11引物經對稱PCR擴增獲得的dsDNA產物進行高通量測序，測序數據經去掉兩端引物序列和兩端adapter，得到10 000條序列，合成拷貝數＞1 000的核酸序列。最終經序列比對獲得了3條與DKK1高特異性結合的核酸適體。獲得的核酸適體文庫中的3條高豐度核酸適體序列，占整個測序文庫總量的54%。核酸適體測序結果（表1）。

表1 核酸適體測序結果

利用DNAman軟件對3條核酸適體經多序列比對和同源性分析。測序結果與預期長度一致，得到的核酸適體中富含G、C堿基，其同源性達78.41%。同時，發現AGCG、AACCA和GGCGT序列均在這3條核酸適體中存在，提示，DKK1可能特異識別CCCCT、CGGTT和TGCGCG 3種保守DNA序列，而其余的序列則有一定的變化（圖3）。

核酸適體是利用其形成特殊的、穩定的二級結構與靶標分子特異結合，因此我們對3條核酸適體的二級結構進行了預測。核酸適體結構主要以莖環結構、莖凸環結構等為主，而且序列中G≡C配對較多。其中莖可以起到穩定核酸適體空間結構的作用，而環與靶標結合。提示莖環結構可能是核酸適體與DKK1特異識別的結構基礎。由此推斷核酸適體與靶標的結合可能是結構依賴性的，而不是序列依賴性的。這與抗原-抗體的結合反應特別相似，但抗體是以初級結構識別抗原決定簇，而核酸適體堿基之間可能是通過疏水作用、堿基堆積力和氫鍵等作用力與靶標形成 “鎖與鑰匙”結構（圖4）。

圖3 核酸適體同源性分析結果

核酸適體的二級結構最低自由能代表了DNA空間結構的穩定性，其最低自由能越小，核酸適體所形成的二級結構越穩定。mfold軟件計算的3個核酸適體的自由能最低能量值。

2.4 DKK1核酸適體Kd值

利用SPR儀測定候選核酸適體（Apt-5、Apt-26、Apt-28）與靶標DKK1的親和力，將固定在SPR芯片上的DKK1分別與不同濃度的核酸適體（1～160 nmol/L）孵育測定其相互作用力。結果顯示，篩選獲得的3條核酸適體與DKK1的結合解離常數均在納摩爾級水平。解離常數值Kd大小與親和力高低成反比，Kd值越小，親和力越大。核酸適體Apt-5、Apt-26、Apt-28的Kd值分別為12.26、24.85、21.18 nmol/L，Apt-5的Kd值最小，親和力最高，Apt-26和Apt-28核酸適體親和力相對較弱（圖5）。

2.5 圓二色光譜的分析結果

利用圓二色光譜進一步研究了DKK1核酸適體分子的高級結構。如圖所示，3個候選核酸適體（Apt-5、Apt-26、Apt-28）在265 nm附近顯示正的特征肩峰譜帶，在240 nm附近顯示負的特征肩峰譜帶，這一性質與G-四鏈體結構的特殊功能一致（圖6）。

圖4 核酸適體二級結構預測結果

3 討論

SELEX技術是一種應用體外合成的大容量的隨機ssDNA文庫進行體外篩選、結合PCR擴增的技術[17-19]。文庫中的寡核苷酸序列可以折疊形成發夾、假結、凸環和G-四分體等空間結構，與靶物質特異、穩定地結合，通過多輪篩選和PCR擴增富集，最終獲得高親和力、高特異性的ssDNA序列，稱為核酸適體。核酸適體具有靶分子范圍廣、相對分子質量小、無免疫原性、易于人工合成、修飾和標記等優點，核酸適體在臨床診斷、基礎研究，甚至在疾病治療領域中都顯現其重要的應用價值。因此核酸適體能夠成為最具前景的抗體替代品。有研究利用合成的DNA適體與熒光淬滅方法可以高通量地檢測和區分體液中不同種類的蛋白質[20]。

本實驗以DKK1為靶蛋白，以羧基化瓊脂磁珠為篩選介質，從體外合成的隨機ssDNA文庫中篩選獲得其特異核酸適體。利用消減SELEX技術，共進行6輪篩選DKK1核酸適體。通過鏈霉親和素磁珠法制備獲得次級ssDNA文庫，有效地避免了不對稱PCR制備過程中產生非特異ssDNA。整個篩選進程通過ELASA法實時監測[21]。篩選獲得的次級核酸適體庫通過高通量測序分離高豐度的一系列單一核酸適體序列[22]。該方法利用高通量測序從而有效地避免了利用傳統方法克隆后測序，造成核酸適體的丟失和不完整。提高了核酸適體篩選的效率。同時，該實驗利用其篩選獲得的特異核酸適體建立一種基于ELISA的快速檢測DKK1的方法，該實驗耗時不足1 h，同時免去了ELISA封閉實驗步驟和反復洗板的過程，成為本研究最大的亮點。此外，本研究采用羧基瓊脂磁珠作為篩選介質，提高了靶蛋白與載體的偶聯率，是目前SELEX篩選中良好的載體材料，使一輪的SELEX篩選時間縮短為2 h。

利用DNAman軟件對其二級結構進行預測分析，結果顯示核酸適體主要以莖環和莖凸環結構為主。序列中GC配對較多。其中莖可以起到穩定核酸適體空間結構的作用，而環與靶標結合。這提示，莖環結構可能是核酸適體與DKK1特異識別的結構基礎。圓二色光譜分析結果顯示，3個候選核酸適體（Apt-5、Apt-26、Apt-28）能特異形成G-四鏈體結構識別DKK1靶標蛋白。同時應用SPR儀的方法對篩選出的核酸適體的親和力進行檢測，結果顯示核酸適體Apt-5 對DKK1有很好的特異性，該技術為檢測血清中的DKK1提供了新的分子生物學方法。

圖5 核酸適體親和力測定結果

圖6 圓二色光譜分析結果