FOXK1基因的生物特性及其在腫瘤中的研究進展

李 燕，陳 瑜，何美芝，卞小慧，涂令境，崔春暉，謝 朗南方醫科大學珠江醫院普通外科，廣東 廣州 508；南方醫科大學第二臨床醫學院，廣東 廣州 5055

在人口結構老齡化、不良的飲食習慣、環境污染等眾多因素的影響下，惡性腫瘤的發病率呈現逐年上升的趨勢。近年來FOXK1基因在腫瘤中的作用受到廣泛的關注，有證據顯示FOXK1在多種細胞的生命活動以及腫瘤的發生、發展過程中扮演了重要角色。有一項關于生物信息學表達的分析表明FOXK1在幼兒腦、眼睛、心臟、肺臟和胸腺的低分化組織表達；而在成年人，FOXK1主要表達于惡性組織，尤其是腦、結直腸和淋巴結腫瘤[1]。本文關注FOXK1基因從第一次報道（1994年）到現在20多年間在腫瘤的研究進展，對FOXK1在各類腫瘤中的表達及作用作一綜述。

1 FOXK1基因的特征

1.1 FOXK1基因的結構特點

自果蠅fork head基因被發現以來[2]，已經在不同物種中發現了許多FOX家族基因。人類叉頭框（FOX）家族為一種轉錄因子家族，包含從A到Q的17個亞族、43個成員，其中FOXA-G、I-L和Q屬于1類FOX亞型，FOXKH及M-P屬于2類FOX亞型[3]。人類FOXK1基因屬于FOX家族成員，因其編碼的蛋白與小鼠肌細胞核因子/FOXK1具有高度同源性而得名。FOX蛋白也被稱作翼狀螺旋蛋白，FOX家族蛋白含有DNA結合區和轉錄調節區，其中DNA結合區又稱“叉頭區”，為各FOX家族亞型的共性結構，約含有100個氨基酸[4]。人源性FOXK1基因位于染色體7p22，包含13個外顯子（圖1）。FOXK1a和FOXK1b為FOXK1的兩種轉錄物變體，它們的5’末端含有一個叉頭框結構，可作為序列特異性DNA結合區域起作用以調節基因轉錄[1]。FOXK1蛋白核心部分為相連的3個α螺旋結構，兩側通過β鏈連接了兩個稱之為“翼”的環狀結構（圖2）。

1.2 FOXK1的蛋白特性及其分布

人源FOXK1蛋白由733個氨基酸排列組成，共約75.5 kDa，其中88.7%的氨基酸序列與鼠源FOXK1同源，48.7%的氨基酸與人FOXK2同源，47.5%氨基酸與非洲蟾蜍FOXK2同源。FOXK1a和FOXK1b蛋白富含丙氨酸、脯氨酸和絲氨酸，均有相同的叉頭域及潛在的核定位信號（PKRR）。FOXK1在胎兒的腦、眼睛、心臟、肺和胸腺表達，成年人FOXK1主要在惡性組織表達，尤其是腦、結直腸和淋巴結腫瘤[1]。通過RNA測序、基因芯片和基因表達的系列分析顯示的FOXK1基因在人體各個組織中的表達（圖3）。另外，來源于HPA的亞細胞定位顯示（圖4），FOXK1蛋白高表達于細胞核，同時在細胞骨架中亦有中等量表達。

圖1 人源性FOXK1基因的染色體定位

圖2 FOXK1的蛋白結構

2 FOXK1基因的生物學功能

2.1 FOXK1調控細胞周期

FOXK1的敲除消除了細胞周期依賴性振蕩并導致細胞增殖率降低，從而肯定FOXK1可作為細胞周期的重要調節分子[5]。FOXK1調節小鼠肌原性祖細胞（MPC）中細胞周期進程和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21，FOXK1的缺乏導致p21表達上調，使生長促進條件下MPC群中的G0/G1停滯[6]，這基本闡明了FOXK1作為癌基因影響細胞周期的一項重要作用機制。此外，FOXK1可直接抑制基因表達激活因子FOXO4的轉錄活性，從而降低其下游包括p21等靶基因，FOXO4的抑制作用導致MPC中p21表達降低，細胞增殖增加[7]。FOXK1可抑制結直腸癌細胞系SW480凋亡，實驗發現在FOXK1基因高表達癌細胞SW480中，細胞生長增殖旺盛，而在敲除FOXK1基因的SW480細胞細胞周期狀態大都停滯于的G0/G1期，未能進一步進展的SW480分裂期細胞進入細胞凋亡期[8]。此外，研究發現FOXK1還參與PLK1-FOXK1-JLP-JNK/p38/MAPK信號通路，與原癌基因PLK1相互識別、作用，促進了其在胞內的磷酸化和轉錄水平，介導細胞從G2期到M期的周期過程，從而參與有絲分裂[9]。

圖4 FOXK1基因的亞細胞定位

2.2 FOXK1介導信號通路

FOX家族成員可通過轉錄調控和信號轉導途徑在機體的生長發育、細胞分化、代謝、凋亡以及免疫等方面起關鍵作用。Wnt/β-catenin通路是指導細胞增殖、自我更新、分化、組織穩態和胚胎發育的重要信號通路[10]。DVL相關蛋白在人類結直腸癌組織高表達，激活Wnt/β-catenin信號通路調控成人組織穩態發展和維持生物過程[11]。β-catenin調節Wnt信號通路的重要組成成分（cyclin-D1、c-myc和基質金屬蛋白酶-7）的表達，導致細胞增殖和侵襲失控。FOXK1可以依賴于β-catenin，將DVL蛋白轉位進入核內從而正向調控Wnt/β-catenin信號通路，在結直腸癌中發揮積極作用[12]。FOXK1還參與了Akt/mTOR信號通路調節miR-646介導的上皮間質轉化（EMT）[13]。FOXK還被證實了可介導胚胎中腸內胚層的TGF-β信號通路，而TGF-β信號也可通過Smad/Mad結合位點直接調節FOXK的表達，形成反饋調節機制[14]。除此之外，FOXK1在各系統腫瘤中的作用還涉及多個信號通路，FOXK1在腫瘤中的表達及具體調控機制（表1）。

2.3 FOXK1與其他基因相互作用

進一步通過STRING篩選出了25種FOXK1相互作用蛋白。蛋白質互相作用的網絡分析（圖5）。FOXK1如何調控相關蛋白的表達并發揮其作用有待進一步探討。

3 FOXK1與各系統腫瘤

3.1 FOXK1基因與卵巢癌

在不影響細胞凋亡的情況下，FOXK1過表達可顯著提高S期細胞百分率，通過促進G1/S相變促進細胞增殖。同時，在卵巢癌細胞系中敲除FOXK1，細胞侵襲標志物MMP-9的表達降低。且FOXK1與細胞周期抑制蛋白p21的啟動子區域存在相互作用，FOXK1的過表達抑制了p21的表達，表明FOXK1通過抑制p21轉錄促進細胞增殖[15]。

3.2 FOXK1基因與肺癌

CCK8和transwell侵襲實驗表明，miR-1275可抑制肺癌細胞的增殖和侵襲，而FOXK1是miR-1275的一個潛在靶點，且miR-1275的過表達抑制了肺癌細胞中FOXK1的mRNA和蛋白水平[16]。這表明miR-1275可以調控肺癌細胞中FOXK1的表達抑制肺癌細胞增殖。進一步實驗表明，circMAN2B2是通過circMAN2B2/miR-1275/FOXK1信號通路在肺癌中發揮致癌作用的。

3.3 FOXK1基因與彌漫大B細胞淋巴瘤

基于微陣列基因表達譜的彌漫性大B細胞淋巴瘤潛在關鍵基因的鑒定中預測FOXK1為抑癌基因miR-17-5p的靶向基因，參與DNA結合FOXK1最有可能通過靶向miR-17通過調節細胞生長和細胞凋亡在彌漫性大B細胞淋巴瘤的進展中起主要作用[17]。

表1 FOXK1在各種腫瘤中的表達及可能機制

3.4 FOXK1基因與前列腺癌

FOXK1在人前列腺癌細胞系中有高表達，其下調抑制了前列腺癌細胞的增殖和遷移，同時上調上皮細胞標志物E-cadherin以及下調間充質細胞標記物N-cadherin的表達從而逆轉EMT過程，這表明FOXK1是一種前列腺癌轉移潛能的潛在增強劑和EMT的誘導劑。此外，FOXK1通過上調β-catenin、c-myc、cyclin D1的表達蛋白水平，對Wnt/β-catenin信號通路起到正向調控作用，促進腫瘤的發生和轉移[18]。

3.5 FOXK1基因與神經膠質瘤

與正常腦組織相比，膠質瘤組織和細胞系中FOXK1的表達增加，其過表達顯著促進了細胞的增殖和周期轉變，且FOXK1可通過激活神經膠質瘤細胞中的Wnt/β-catenin通路促進細胞生長[19]。同時，研究發現FOXK1在神經膠質瘤中的作用受到抑癌基因miR-137的靶向負調控。

然而另有研究表明，在膠質瘤組織和細胞中FOXK1的表達是下降的，且FOXK1的過度表達顯著抑制膠質瘤細胞的增殖，遷移和侵襲。FOXK1可以與其下游分子MMP1、MMP9和VE-Cadherin的啟動子結合，抑制轉錄。具有高FOXK1表達的神經膠質瘤比具有低表達的神經膠質瘤具有更長的存活時間[20]。ZRANB2是在大鼠腎小球旁細胞原代培養的差異性顯示實驗中發現的一種蛋白質[21]。ZRANB2的抑制降低了長鏈非編碼RNA（lncRNA）SNHG20的穩定性和表達，而下調的SNHG20可通過SMD途徑降低轉錄因子FOXK1 mRNA降解，從而增加FOXK1的表達。FOXK1下調血管生成擬態相關分子MMP1、MMP9、VE-鈣粘蛋白的水平，并抑制神經膠質瘤細胞中的血管生成擬態形成[20]。

膠質母細胞瘤（GBM）是星形細胞腫瘤中惡性程度最高的膠質瘤，FOXK1在GBM組織和細胞系中過表達，其通過激活Snail的轉錄促進GBM細胞的EMT，從而促進GBM細胞的轉移，同時還可以通過調控細胞周期促進GBM細胞的增殖[22]。

3.6 FOXK1基因與乳腺癌

在乳腺癌細胞系中FOXK1的表達下降，它在體內外均可抑制EMT和乳腺癌細胞的轉移，且FOXK1表達越高，乳腺癌預后越好[23]。通過進一步的實驗發現，FOXK1通過抑制轉錄因子Twist和血管內皮生長因子等關鍵致癌基因的轉錄，從而抑制乳腺癌EMT及血管生成，因此，在乳腺癌中FOXK1是一種潛在的腫瘤抑制因子。FOXK1還可以增強乳腺癌MRI表型的檢測，并且與調節乳腺癌生長和轉移的腫瘤抑制因子TET1在生理功能上存在相互關聯。

3.7 FOXK1基因與食管癌

免疫組化實驗表明，與正常食管黏膜組織相比，FOXK1在食管癌組織的表達顯著增多。其表達水平與食管癌的分化程度相關，分化程度越低的腫瘤組織FOXK1的表達水平越低，且FOXK1的高表達是影響食管癌患者的預后及生存時間的作用因素，提示FOXK1可能成為食管癌患者的診療新靶點[24]。進一步的細胞實驗發現，提高食管癌細胞內FOXK1的表達水平，可抑制細胞凋亡、促進細胞增殖和侵襲轉移，而在食管癌細胞內抑制FOXK1的表達則得出相反的結果。

3.8 FOXK1與肝細胞性肝癌

FOXK1高表達于肝細胞性肝癌（HCC）組織細胞，敲除FOXK1基因可下調HCC細胞內β-catenin、cmyc和cyclin D1等蛋白的表達水平，相反，Wnt/βcatenin信號通路催化劑LiCl有效地逆轉FOXK1敲除導致的HCC細胞增殖和侵襲效應。且有研究報道FOXK在胚胎中腸內胚層中介導TGF-β信號，因此TGF-β-FOXK1-Wnt信號可能在調控HCC細胞增殖和侵襲中發揮重要作用[25]。此外，Cui等[26]研究發現，FOXK1的下調可以抑制肝癌細胞糖酵解、降低肝癌細胞活力，這可能與其降低糖酵解關鍵酶HK2的表達有關。Akt/mTOR通路被證實可以通過刺激葡萄糖消耗和乳酸產生、激活HK2等途徑從而增加細胞的葡萄糖攝取和糖酵解。Cui等[26]通過進一步的研究發現FOXK1的下調抑制了肝癌細胞中Akt/mTOR通路的激活，導致細胞糖酵解的抑制。

3.9 FOXK1基因與胃癌

FOXK1和原癌基因c-jun均表達于胃癌細胞核，c-jun可直接結合并激活人FOXK1基因啟動子362-355 bp核心序列處；過表達FOXKl的MKN28穩定株沉默c-jun序列后，細胞的增殖、遷移和侵襲能力受抑制，FOXKl誘導的EMT也同樣受到阻礙[27]。因此，FOXKl的啟動子被c-jun識別激活后表達上調，發揮原癌基因作用促進胃癌進展。另有研究指出，miR-646為FOXK1在胃癌細胞中表達的調控基因，miR-646可通過下調FOXK1對抗TGF-β1誘導EMT亞型，抑制Bcl-2/Akt信號通路，從而抑制GC細胞增殖、轉移和侵襲[13]。lncRNA LINC02163被證實參與胃癌的發生及發展，它在胃癌細胞系和組織中的表達增高。LINCO2163的抑制降低了FOXK1的表達，而當miR-593-3p被抑制時，LINC02163下調FOXK1表達的作用被消除。FOXK1過表達可抵消LINC02163下調對細胞生長、細胞周期分布和侵襲的影響[28]。因此，LINC02163可以通過miR-593-3p/FOXK1軸發揮其在胃癌中的癌基因作用。此外，在胃癌的發生發展中FOXK1與波形蛋白存在相互穩定和相互促進作用，其在胃癌細胞中的表達呈顯著正相關。在胃癌細胞中FOXK1誘導EMT，促進胃癌的侵襲及轉移，與胃癌的不良預后有關[28]。

3.10 FOXK1與結直腸癌

目前，關于FOXK1在結直腸癌的表達特點及其分子作用機制的研究最為廣泛和深入。FOXK1在結直腸腫瘤著高表達，且其表達水平與患者的預后呈負相關，對其預后狀態的單因素及多因素回歸分析提示FOXK1在腫瘤組織中的表達為結直腸癌患者獨立的預后因素[29]。有研究發現敲除FOXK1可誘導結直腸癌SW480細胞在G0/G1期阻滯[8]，由此提出FOXK1可能成為結直腸癌侵襲性的生物表型標志物和基因干預治療的新靶標。而FOXK1和FHL2的共表達可誘導EMT促進結直腸癌細胞的增殖和轉移，TGF-β1可上調LIM蛋白家族成員FHL2的表達，從而賦予癌細胞以轉移的功能[30]，一系列的研究結果使FOXK1和FHL成為聯合治療結直腸癌特別是轉移性結直腸癌的潛在靶點[31]。在體內結直腸癌中觀察到，FOXK1的蛋白水平和細胞定位與RUFY3相似，RUFY3高表達可促進體內和體外結直腸癌細胞增殖，加強EMT和轉移亞型，而siRNA介導抑制RUFY3可誘導G0/G1細胞周期阻滯，FOXK1被證實可通過原位移植促進RUFY3介導的轉移FOXK1- RUFY3軸的形成促成且加快了結直腸癌的疾病進展[32]。除此之外，通過基因表達譜、蛋白印跡分析和相關性等分析發現，在結直腸癌細胞中，FOXK1的表達還與轉錄因子Snail呈正相關。進一步研究發現，Snail可與FOXK1啟動子結合，反式激活FOXK1表達，從而促進結直腸癌腫瘤發生和EMT介導的侵襲轉移。此外，熒光素酶報告基因測定顯示FOXK1反式激活Cyr61啟動子活性，它們的共同表達調控了結直腸癌細胞的遷移、侵襲和EMT[33-34]，因而靶向FOXK1-Cyr61-Snail軸可以為結直腸癌的治療提供新的治療方向。另外，熒光素酶報告基因測定發現miR-4492與結直腸癌結直腸癌細胞中的lncRNA LINC01503和FOXK1 mRNA存在相互作用，LINC01503通過抑制miR-4492在結直腸癌細胞中促進FOXK1的表達，而CCK8和Transwell測定表明FOXK1表達的恢復顯著逆轉了LINC01503敲低對結直腸癌細胞的抑制作用。

4 總結

綜上所述，FOXK1參與EMT，介導TGF-β、Wnt/βcatenin和Bcl-2/Akt等多個信號通路，影響不同系統腫瘤細胞的增殖、轉移和侵襲。FOXK1在腫瘤中作為一個新興的原癌基因，對各個系統腫瘤細胞的發生、發展及預后起重要的作用。然而，與其他的腫瘤標志物相比，FOXK1的研究尚處于初步階段，它的生物學功能及其影響各個系統腫瘤的具體機制還需進一步的深入研究。FOXK1有望成為不同系統腫瘤新的生物標記物及作用靶點，為患者的診斷、治療及預后帶來新的曙光。