多殺性巴氏桿菌脂多糖的結構和作用研究進展

冀夢瑤，于秀劍，杜萬年，史秋梅，吳同壘

(河北科技師范學院動物科技學院，河北 秦皇島，066600)

1 由多殺性巴氏桿菌引起的疾病及其毒力因子

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)是許多脊椎動物口咽部的常在菌，也是引發某些疾病的機會性致病菌，可引起有蹄動物的出血性敗血癥、禽霍亂、豬萎縮性鼻炎和兔鼻炎[1]。此外，Pm還會與其他致病微生物混合感染，比如牛呼吸道綜合征和地方流行性肺炎。Pm也是人類軟組織創傷后繼發感染的常見病原，在犬貓咬傷的一半病例中會出現。

出血性敗血癥是一種有蹄類動物的急性傳染病，給許多國家造成重大經濟損失。Pm首先侵入扁桃體，逐步擴散至全身，并迅速發展為致死性敗血癥，臨床癥狀表現為高熱、水腫、呼吸困難、膿毒、廣泛出血。一旦發病，動物迅速死亡，死亡率接近100%[2,3]。禽霍亂是一種急性傳染病，發病急，死亡率高，通過呼吸道感染禽類，繼而發展為全身性感染，急性和亞急性臨床表現主要為高熱、呼吸困難、口鼻分泌物增加、雞冠肉髯呈現青紫色，而慢性型主要是關節和鼻竇的炎癥。豬萎縮性鼻炎是導致豬鼻甲骨萎縮和鼻中隔彎曲的疾病。多殺性毒素(Pasteurellamultocidatoxin，PMT)是導致萎縮性鼻炎的主要致病因素，PMT是一種146 ku的蛋白質，通過受體介導的內吞作用，捕獲宿主細胞的唾液酸神經節苷脂表面受體和帶正電荷的磷脂來發揮致病效應。另外，PMT蛋白的羧基端部分通過激活G蛋白及其耦聯的宿主細胞信號通路，抑制成骨細胞分化，導致病畜出現鼻甲骨萎縮[4]。

目前有關Pm毒力因子的報道較為少見，僅有少數幾個毒力因子被鑒定，例如脂多糖(LPS)是多殺性巴氏桿菌最為關鍵的毒力因子，在其致病機制中發揮重要作用。PMT是引起萎縮性鼻炎的菌株的關鍵毒力因子；莢膜是引起出血性敗血癥和禽霍亂的菌株的關鍵毒力因子[5]；絲狀凝集素樣黏附素是引發禽霍亂和牛肺炎的菌株的毒力因子。此外，LPS還可刺激宿主適應性免疫應答，從而產生保護性免疫反應[6]。LPS也是對菌株進行血清學鑒定時的重要依據，是多種Pm分型系統的主要鑒別抗原[7,8]。筆者在此重點綜述Pm的LPS的結構及其在所致疾病、誘導宿主免疫和菌株分型中的作用，以期為完整的致病機制確認、診斷試劑以及疫苗研發提供一定參考。

2 多殺性巴氏桿菌LPS的共同特性

Pm的細胞壁主要由LPS組成，LPS與細菌適應外界環境、毒力強弱和刺激宿主免疫反應等方面密切相關。LPS主要由4個部分組成，即：脂質A，多糖內核，多糖外核和糖側鏈(O-抗原)。脂質A是LPS的主要功能成分，是能被宿主細胞Toll樣受體(TLR4)識別的重要病原相關分子模式(PAMP)，可刺激產生先天性免疫應答。當機體受到感染時，脂質A可與細胞質中的脂多糖結合蛋白(LBP)結合，形成LPS/LBP，后者為吞噬細胞表面的CD14受體識別，之后吞噬細胞將LPS/LBP遞呈給已經耦聯了TLR4的髓樣分化因子2(MD2)，隨后TLR4寡聚化觸發細胞內信號級聯反應和NF-κB通路活化，導致促炎因子的表達和釋放，從而參與炎癥反應[9]。當細菌侵入黏膜時，炎癥部位附近未成熟的樹突狀細胞結合LPS/LBP，形成復合物(通過CD14/MD2受體)，激活TLR4，使樹突狀細胞轉化為成熟的抗原呈遞細胞，然后遷移到局部淋巴結啟動適應性免疫應答，進而激活一系列抗原特異性T淋巴細胞，啟動B細胞群的活化增殖，產生針對LPS的特異性抗體。由于內源性和外源性抗原的交叉遞呈作用，細胞免疫應答也可被激活，但這取決于入侵細菌的特性以及CD4+T輔助細胞是否被募集到感染部位[10]。

脂質A決定了Pm血清型，結構基礎取決于其酰基鏈數、長度、磷酸化和糖基化的變化。20世紀70年代，科學家利用瓊脂擴散試驗和多克隆抗體將Pm菌株分為16種不同的血清型，人們把這種分型方式稱為Heddleston分型系統，它代表16種不同結構的LPS分子[11]。由于未解析Pm菌株LPS的精確分子結構，因此目前無法證實Heddleston血清型與LPS結構和宿主免疫應答之間的關系。對已知確定的16種Heddleston血清型菌株LPS的分子結構進行解析，能夠幫助研究者更加清楚的了解特定的LPS結構在毒力和宿主免疫刺激中的作用。

3 LPS多糖內核的分類

LPS多糖內核區域和多糖外核區域的結構已經確定用于細菌鑒定，例如Heddleston血清型的分類。大多數革蘭陰性菌的內核區域為糖結構，其組成為自3個與脂質A連接的3-脫氧-D-甘露-辛-2-酮磺酸殘基(Kdo)開始，到葡萄糖殘基止，再往外是多糖外核。根據Kdo的修飾基團不同，Pm菌株可分為2種多糖內核，稱為糖型A和糖型B[12]。糖型A和B主要是由Kdo轉移酶KdtA和Kdo磷酸化酶KdkA的相對活性決定，并可相互轉換。到目前為止檢測的菌株中，大部分菌株的LPS多糖內核是糖型A類型的，很少一部分是糖型B類型。

4 LPS多糖外核的分類

Pm多變的多糖外核決定了Pm的血清型。15種不同的LPS多糖外核可分為16種Heddleston 血清型，這15種多糖外核由8種基因座編碼而成，它們分別是L1～L8。

含有L1基因座的菌株包括Heddleston 1和14血清型。對從感染的禽類中分離的48株Pm菌株進行的分析確定，有11株(23%)包含L1基因座。對這些菌株中的6個菌株進行了分析，結果顯示5株菌形成了全長L1型LPS，一株菌產生截短的L1型LPS；有研究表明[13]，由于PCho基因的喪失，菌株表達截短的L1型LPS，并導致其對禽類體內抗菌肽的敏感性增加，不利于細菌的存活。上述現象提示，攜帶全長L1型LPS的菌株一旦進入禽類體內后有著一定的存活優勢。為了進一步的驗證，利用LPS多糖外核截短表達的突變菌株對雞進行感染實驗，結果顯示，只能在注射部位檢測到突變菌株，血液中沒有檢測到，這也說明了突變菌株感染后不能進入血液造成敗血癥[14]。

含有L2基因座的菌株為Heddleston 2和5血清型，其LPS多糖外核含有庚糖殘基，根據庚糖殘基上是否連接磷酸乙醇胺，可將L2 LPS菌株分為Heddleston 2血清型(不攜帶磷酸乙醇胺)和Heddleston 5血清型(攜帶磷酸乙醇胺)。導致有蹄類動物的溶血性敗血癥的菌株，均為Heddleston 2血清型。

攜帶L3基因座的菌株為Heddleston 3和4血清型，兩種血清型之間存在一定的交叉反應，是引起禽霍亂的主要菌株類型。L3基因座表達的LPS多糖外核長度變化多端，可自然發生截短表達。盡管L3基因座編碼的LPS結構上模擬宿主鞘糖脂，但禽類在免疫接種攜帶L3基因座的菌苗后，能夠產生保護性抗體。

含有L4 LPS基因型的菌株為Heddleston 6和7血清型，代表菌株為P2192和P1997。Heddleston 6血清型菌株P2192表達全長L4多糖外核，Heddleston 7血清型菌株P1997表達高度截短的L4多糖外核。研究顯示，引起禽霍亂的Pm攜帶L4多糖外核的幾率不高。從火雞體內分離的Heddleston 16型菌株P2723是已知攜帶L8基因座的唯一1株Pm[15]。

含有L5基因座的菌株為Heddleston 9血清型菌株，代表菌株為P2095。菌株P2095多糖外核含有鼠李糖(Rha)和3-乙酰氨基-3,6-二脫氧-D-葡萄糖(Qui3NAc)殘基，這是迄今為止鑒定出的唯一含有鼠李糖或Qui3NAc的Pm[16]。

含有L6基因座的菌株為Heddleston10，11，12和15血清型，代表菌株分別為P2100，P908，P2237和P1573，該基因座含有7個糖基轉移酶基因。Heddleston 12血清型菌株P2237產生最長的L6型LPS，其余血清型均為不同長度截短表達多糖外核的菌株。

含有L7基因座的菌株為Heddleston 8和13血清型，代表菌株分別是P1581和P1591。P1581菌株產生更長的LPS，外核包含1個葡糖糖殘基，2個半乳糖殘基，1個磷酸乙醇胺殘基和1個磷酸甘油殘基，而P1591菌株的多糖外核缺少磷酸甘油殘基[17]。

5 LPS在滅活疫苗和減毒活疫苗中的作用

目前已經研發了一系列Pm疫苗來預防相關疾病，包括減毒活疫苗、滅活苗兩大類。滅活苗產生的免疫保護與LPS的多糖外核相關，具有明顯的血清型特異性(同源保護)[18]。而減毒活疫苗可為宿主提供針對多種血清型菌株的免疫保護(異源保護)[19]，減毒活疫苗產生的免疫保護不依賴LPS的多糖外核結構。例如，用含有VP161(L1親本菌株)的滅活苗免疫雞可提供較高的保護效果，但對LPS多糖截短表達的菌株感染保護力大大降低；親本菌株P1059 制備的滅活苗可為具有相同LPS結構的菌株P1059gatG突變株和菌株PM1422提供相同保護，但對于LPS多糖外核不同的菌株，保護力較低。這些數據有力地表明，使用滅活苗的重要前提是，疫苗菌株與疾病病原體產生的相同或幾乎相同的LPS結構，如果LPS結構不同，則不會提供保護性作用[20]。

與滅活苗不同，多殺性巴氏桿菌活疫苗可以針對多種血清型菌株產生免疫保護，不依賴于LPS結構，可為宿主提供更為廣泛的免疫保護。進一步的深入研究表明，多殺性巴氏桿菌活疫苗株可刺激機體產生細胞免疫，Th17細胞幫助宿主募集嗜中性粒細胞，清除黏膜表面的細菌，但是這種作用不能用于區分不同類型的LPS[21,22]，這可能是活疫苗能夠為不同血清型巴氏桿菌提供免疫保護的重要原因。

6 展 望

多殺性巴氏桿菌的脂多糖(LPS)是其主要的毒力因子，在感染宿主的過程中發揮重要的作用，不同血清型的菌株LPS的結構差異較大，與其宿主嗜性和致病特征具有密切聯系。在多殺性巴氏桿菌感染宿主時，LPS還可模擬宿主分子結構，以維持在宿主體內的存活，另外，可刺激宿主產生以炎癥反應為主要特征的免疫應答，這可能是細菌發揮其致病性的原因之一。針對多殺性巴氏桿菌的滅活疫苗，需要有相同的或者相似的LPS結構，才可以發揮保護作用，弱毒疫苗可以產生廣泛的保護。筆者對多殺性巴氏桿菌的LPS的結構和功能進行了簡要總結，但是限于多殺性巴氏桿菌的研究較少，仍有很多問題亟待進一步研究。多殺性巴氏桿菌LPS的脂質A的結構到底是怎么樣的,是否其在酰基鏈長度和修飾上不同于其他細菌的脂質A結構；脂質A是否可通過TLR4/MD-2途徑激活宿主細胞的炎癥通路，誘導炎性因子表達和釋放；為什么環境中多殺性巴氏桿菌多糖內核以A型為主，多糖內核為B型的菌株較少見；多殺性巴氏桿菌是否同其他細菌一樣，也能利用自身的LPS多糖內核抵御宿主補體的殺傷；是否可通過分子模擬等方式降低宿主的免疫識別和防御能力。這些問題可為多殺性巴氏桿菌的致病機制、疫苗和診斷試劑研發提供重要的理論基礎，需進一步揭示。