雞TRAFs家族成員鑒定及生物信息學分析

孟 婕，任一帆，張 貝，耿立英，張傳生，李祥龍

(河北科技師范學院 河北省特色動物種質資源挖掘與創新重點實驗室，河北 秦皇島，066600)

疾病是制約我國養禽業發展的重要因素，從遺傳角度出發，鑒定免疫相關的抗病基因，利用其培育抗病新品種，對養禽業疾病的徹底根治具有較好的理論和實踐意義[1，2]。腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAFs)，是機體抗病毒信號通路中重要的接頭分子。它主要通過參與腫瘤壞死因子受體家族(TNFR)、Toll樣受體/白細胞介素-1受體家族(TIR)和維甲酸誘導基因Ⅰ樣受體家族(RLRs)轉導上游信號[3～5]，激活NF-κB(nuclear factor κB)，MAPK(mitogen-activated protein kinase)和IRF(Interferon regulatory factors)下游通路[5，6]。目前已發現TRAFs家族有7個成員，分別命名為TRAF1，TRAF2，TRAF3，TRAF4，TRAF5，TRAF6和TRAF7。對哺乳動物的研究發現該蛋白在物種進化上較為保守，TRAFs的C端(TRAF7除外)有一個具有共同特征的TRAF結構域；除TRAF1的N端只有一個簡單的鋅指結構外，其他TRAFs分子都含有若干個鋅指結構和一個RING指基序[7～10]。

隨著雞基因組測序的完成，使得在基因組水平上研究雞TRAFs家族的信息成為可能。本次研究擬對雞TRAFs家族成員進行鑒定，通過蛋白質理化性質、系統進化關系、基因結構、直系和旁系同源基因的研究，為進一步研究TRAFs家族的功能、揭示雞TRAFs家族抗病分子機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 雞TRAFs家族成員的鑒定與序列特征分析

從Ensemble數據庫(https://asia.ensembl.org/index.html)下載雞基因組序列信息和基因組基因結構注釋信息文件。以Pfam蛋白家族數據庫(http://pfam.xfam.org/)下載TRAF(PF00917，PF02176)的隱馬可夫模型(Hidden Markov Model，HMM)作為查詢搜索獲得雞可能TRAFs的蛋白序列，并利用Batch CD-Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)及 SMART(http://smart.emblheidelberg.de/)進行驗證分析，刪除缺失結構域的序列，最終獲得雞TRAFs家族候選基因。利用在線工具ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)預測雞TRAFs家族成員的等電點和蛋白分子量等屬性。

1.2 雞TRAFs家族系統進化樹的構建

從NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載鼠和人的TRAFs蛋白序列，將其與雞TRAF蛋白序列整合。利用MEGA X的clustal W將鼠、人和雞TRAF蛋白序列進行多序列比對分析[11]。并通過鄰接法(Neighbour-Joining，NJ)在MEGA X中構建系統進化樹，自展值(Bootstrap)設定為1 000。

1.3 雞TRAFs家族成員結構和保守域分析

TRAF的外顯子和內含子位置信息參考雞基因組注釋信息GFF3文件，之后利用TBtools工具繪制雞TRAF基因在染色體上的位置及CDS(外顯子)-內含子結構[12]。利用在線網站MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)預測分析TRAF蛋白序列的結構域，搜索motif值設定為10。通過TBtools工具繪制MEME結構并繪制TRAF的結構域[13]。

1.4 雞TRAFs家族染色體定位和基因復制類型分析

利用下載的雞基因組序列信息和基因組基因結構注釋信息文件通過TBtools工具提取位置信息并構建雞染色體定位圖。TRAF在雞基因組中的復制類型由TBtools及其他輔助工具獲得，并標注在染色體上。

1.5 TRAFs家族共線性分析

通過TBtools工具的Graphics板塊結合基因組序列信息和基因組基因結構注釋信息GFF3文件對雞、鴨、鵝等3個物種進行分析。用Multipe synteny plot對物種間的共線性進行可視化[13]。

2 結果與分析

2.1 雞TRAFs家族的鑒定及理化性質

用生物信息學方法并經過后續的篩選驗證，去掉重復項后從雞全基因組中得到7條基因序列。將7條雞TRAFs家族基因序列按照基因ID從ChTRAF1～ChTRAF7命名。最后對雞TRAFs家族進行蛋白理化性質分析，結果見表1。雞TRAFs家族的氨基酸序列長度最長的為670 aa，最短的為195 aa。家族成員蛋白分子量最大的是74 943.36 ku，最小的為22 329.87 ku。從理論等電點來看，ChTRAF1，ChTRAF6和ChTRAF7的等電點小于7，為酸性蛋白。其中，ChTRAF6的等電點最小，為6.01。ChTRAF家族不穩定系數均大于40，鑒定為不穩定蛋白。所有成員的疏水性都小于零，均為親水蛋白。

2.2 雞TRAFs家族與外群TRAFs家族系統進化樹分析

為了進一步了解雞TRAFs家族和鼠、人之間的同源關系，用雞、鼠和人的蛋白序列構建系統進化樹。系統進化分析表明，雞的7個TRAF基因可分為7組(圖1)。7個成員與鼠和人的TRAF家族成員分別聚集，說明其進化關系較近。雞多個亞家族的成員與鼠和人對應亞家族的相似性達100%。

表1 雞TRAFs家族理化性質分析

注：ChTRAF表示雞，h表示人，m表示鼠。羅馬數字表示亞家族分類。遺傳距離標尺顯示在左下角。節點上的值為通過Bootstrap檢驗次數的百分數。圖1 雞、老鼠、人TRAFs家族系統進化樹

2.3 雞TRAFs家族結構特征分析

利用TBtools工具繪制了雞TRAFs家族成員的結構特征圖。對雞TRAFs家族的7個成員進行了蛋白保守結構域分析，共獲取了10個保守motif元件(圖2)。不同TRAF保守基元數量從4～10不等且分布不同，整體來說，亞家族Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅴ保守基元分布相似。亞家族Ⅳ的編碼序列較其他亞家族結構簡單。TRAF的保守結構域多位于N端。Ⅳ亞家族的內含子數量最少，而且從基因全長來看，有著相似CDS長度的基因全長不一樣，說明內含子長度具有較大差異性。

圖2 雞TRAFs家族成員的保守基序與基因結構

雞TRAFs家族成員的蛋白結構域特征見圖3。N端都有一個RING結構域，ChTRAF7的C末端為7個重復的WD40。TBtools作圖顯示，TRAF1結構域與前人研究結果不符，N端存在RING結構域(圖4)。

圖3 雞TRAFs家族成員特征結構域

圖4 TRAF1成員特征結構域

2.4 雞TRAFs家族的染色體定位分析

雞TRAF染色體位置信息顯示，7條基因不均勻的分布在3號、5號、14號、17號和19號等5條染色體上(圖5)，其中ChTRAF5基因定位在3號染色體上，ChTRAF3和ChTRAF6基因定位在5號染色體上，ChTRAF7基因定位在14號染色體上，ChTRAF1和ChTRAF2基因定位在17號染色體上，ChTRAF4基因定位在19號染色體上。同一條染色體上的基因分布不相連，不存在重復區域。

圖5 TRAF在雞染色體上的位置

2.5 TRAFs家族共線性分析及可視化

雞、鴨和鵝之間的共線性關系見圖6。除了ChTRAF4之外，其余6個雞TRAF基因可以在鴨和鵝染色體上找到對應的旁系同源基因。

圖6 雞、鴨和鵝TRAFs家族共線性分析結果

3 討 論

TRAF家族成員屬于一個重要的信號轉導家族，存在于各種動物中。TRAFs家族的全基因組鑒定僅在極少數物種中被分析報道[15～17]。TRAF1和TRAF2主要參與介導抗凋亡信號、受體信號的反饋調節及JNK的活化；TRAF3參與介導T細胞依賴的抗病毒機制；TRAF4與氣管的形成有關；TRAF5介導CD40與CD27信號；TRAF6可直接與白細胞介素受體相關激酶、NF-κB受體激活因子及CD40結合來參與信號轉導；TRAF7主要介導caspase依賴的凋亡信號[18～20]。雖然雞TRAFs家族成員在先天免疫系統中的作用已有報道[21，22]，然而雞TRAFs家族的系統鑒定鮮有報道。

本次研究通過隱馬可夫模型對雞基因組中TRAFs家族的搜索分析，鑒定其有7個成員。ChTRAF基因家族可分為7個亞家族，Ⅴ亞家族定位在3號染色體上，Ⅲ和Ⅵ亞家族定位在5號染色體上，Ⅶ亞家族定位在14號染色體上，Ⅰ和Ⅱ亞家族定位在17號染色體上，Ⅳ亞家族定位在19號染色體上。對雞中TRAFs家族進行多方面的分析鑒定，發現ChTRAF1，ChTRAF6和ChTRAF7的等電點小于7，為酸性蛋白。ChTRAF家族不穩定系數均大于40，鑒定為不穩定蛋白。所有成員的疏水性都小于零，均為親水蛋白。對染色體定位分析發現，雞TRAFs家族成員不存在串聯重復關系，說明基因間差異較大。通過共線性分析發現，只有6個基因在不同物種之間找到了旁系同源基因，說明TRAFs家族成員在不同物種的進化過程中，承受不同的選擇壓力但也存在一定保守性。

基因結構是研究基因功能和基因進化的重要依據。本次研究詳細分析了雞TRAFs家族的結構特征和保守結構域。基因都含有外顯子內含子，從基因全長來看，有著相似CDS長度的基因全長不一樣，說明內含子長度具有較大差異性。功能域分析發現，每條基因所翻譯的蛋白結構中都含有該亞家族的特征結構域。ChTRAF家族成員含有典型的TRAF分子的功能結構域，包括MATH結構域、指環結構域和鋅指結構域[23]。Bradley等[7]研究顯示，TRAF1在N端沒有RING結構域，但本次研究鑒定表明ChTRAF1的N端含有RING結構域。在NCBI搜索人、鼠、日本鵪鶉等物種的TRAF1蛋白序列進行特征結構域分析顯示，某些物種TRAF1的N端含有RING結構域(圖4)。這一現象表明，TRAFs家族在物種間進化保守的同時有物種差異性。