茶輪斑病致病病原菌的鑒定

張 欣，盧聲潔，程宇豪，王坤英，張金峰，周玉鋒*

(1.貴州省農業科學院 生物技術研究所，貴州 貴陽 550006； 2.貴州大學 茶學院，貴州 貴陽 550025； 3.貴州省農業科學院 茶葉研究所，貴州 貴陽 550006)

茶樹〔Camelliasinensis(L.) O. Ktze.〕是山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)多年生灌木或喬木植物，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區。茶樹主要的經濟價值在于茶葉，其含有豐富的茶多酚、茶氨酸、茶色素和茶多糖等生物活性物質，對調節人體代謝[1]、降血糖[2]、防癌抗癌[3]、抗氧化及增強免疫力[4]具有重要作用。為助力鄉村振興，打贏脫貧攻堅總決戰，貴州大力發展茶產業[5]。據統計，截止2019年底，貴州茶園面積已達46.56萬hm2，位居全國第二。隨著茶樹種植面積不斷擴大，茶樹病害發生呈逐年上升趨勢。

近年來，我國對茶輪斑病病原菌鑒定有陸續報道，發現引起該病的病原菌具有多樣性。CHEN等[6]研究發現，重慶茶區茶輪斑病病原為P.chamaeropis；WANG等[7]分離出P.chamaeropis、P.kenyana、P.rhodomytus、P.sichuanenbsis及P.camelliae等病原菌均能引起茶輪斑病。茶輪斑病是一種主要危害成葉和老葉，在嫩葉和葉梢也常有發生的嚴重影響茶葉產量和質量的病害[10-11]，在高溫高濕等氣候影響下，茶輪斑病容易大面積發生[8-11]。對于該病的防控，主要采取化學藥劑和拮抗菌的防治方法。郭世保等[12]通過室內藥劑篩選發現，藥劑阿米西達和世高對茶輪斑病具有較好的田間防控效果；洪永聰等[13]研究發現，芽孢桿菌(Bacillussp.)可抑制茶輪斑病病原菌的菌絲生長和孢子萌發。

2020年7月，筆者在貴州省銅仁市石阡縣進行田間調查時發現茶樹上一種葉片病害，該病害主要表現為在成葉和老葉上常形成同心輪紋病斑，黃褐色，輪紋中央散生黑色圓形顆粒。為明確該病的病原菌并為其防控提供參考，采用單孢分離法從病葉上分離、純化病原菌，結合形態學和分子生物學方法對其進行鑒定及致病性測試。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茶樹病害標本 2020年7月采自貴州省銅仁市石阡縣五德鎮長興村茶場。標本置于信封，貼上標簽(注明采集時間、地點、經緯度、采集人等)后密封，帶回實驗室進行分離鑒定。

1.1.2 試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基，燕麥瓊脂(OA)培養基，滅菌后備用[14]；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)；引物ITS4(5’-TCCTCCGCTT

ATTGATATGC-3’)和ITS5(5’-GGAAGTAAAA

GTCGTAACAAGG-3’)[15]，EF1-526F(5’-GTCGT

YGTYATYGGHCAYGT-3’)和EF1-1567R(5’-ACHGTRCCRATACCACCRATCT T-3’)[16-17]，BT2A(5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’)和BT2B(5’-ACCCTCAGTGTA GTGACCC TTGGC-3’)[17-18]，均由重慶擎科生物技術有限公司合成。

1.1.3 儀器設備 GL100DP立式自動壓力蒸汽滅菌鍋，致徽(廈門)儀器有限公司；SJ-CJ-2FD雙人單面超凈工作臺，蘇潔醫療機械(蘇州)有限公司；BSP-250生化培養箱，上海博訊實業有限公司；LEICA DM4B光學顯微鏡，北京瑞科中儀科技有限公司；T100 Thermal Cycling PCR 儀，BIORED；WGL-65B電熱鼓風干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化 采用單孢分離法對病原菌進行分離[19]；將菌絲接種至PDA培養基中進行菌絲純化。研究標本及分離所得菌株均保存于貴州省農業科學院生物技術研究所。

1.2.2 致病性測定 對分離的菌株SQ-20-1采用針刺法進行致病性測定。菌株在PDA培養基培養14 d后，用直徑6 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅回接至刺傷的福鼎大白茶葉片上，菌絲面接觸葉片，外蓋一層無菌水浸泡的無菌脫脂棉用以保濕。以接種無菌PDA培養基作空白對照。將接種后的葉片置于25℃光照培養箱內進行培養，3 d后去掉菌餅和無菌脫脂棉并記錄發病情況。每個處理3次重復。

1.2.3 形態學觀察 將供試菌株轉接至PDA和OA培養基中，于25℃恒溫培養箱培養7 d，待菌落產孢后，制作合格玻片放于光學顯微鏡觀察分生孢子梗及產孢細胞等的形態結構。測量30個產孢細胞及40～50個分生孢子的大小并取平均值。

1.2.4 DNA的提取與PCR擴增及測序 先用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取病原菌的DNA。然后采用ITS4/ITS5、EF1-526F/EF1-1567R和BT2A/BT2B進行PCR擴增。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度。最后送樣至重慶擎科生物技術有限公司進行DNA測序。

1.2.5 多基因系統學分析 用Bioedit檢測和拼接基因序列，拼接后的序列上傳至美國國立生物技術信息中心(NCBI)進行比對，確定其屬的劃分。從GenBank中下載相關序列(表1)，用Bioedit 7.0.9.0和ClustalX 1.81將序列進行對齊(Alignment)以及必要的手工比對[20-21]。采用最大簡約法(Maximum Parsimony，MP)[22]和最大似然法 (Maximum Likelihood，ML)[23]聯合ITS、β-tubulin和tef1的擴增基因片段進行系統發育分析。

表1 用于構建系統進化樹的菌株及 GenBank 登錄號

續表1

2 結果與分析

2.1 病原菌形態學鑒定

田間調查發現，該病害主要危害茶樹的成葉和老葉。從圖1看出，該病原菌多由葉緣或葉尖開始侵染，病斑初期呈黃褐色小斑，后漸擴展成圓形或橢圓形褐色病斑，病斑中央隆起并產生輪紋，灰白色至褐色，沿輪紋產生黑色圓形小顆粒。病原菌在25℃下培養7 d，菌落直徑達8 cm；菌落初期毛絨狀/絮狀，白色，背面白色至淡黃色。菌落中央散生黑色、圓形分生孢子盤，其上產生墨汁滴狀黏液。產孢細胞呈棍棒狀，透明，大小為(10.4～18.3) μm×(1.2～4.2) μm。分生孢子由5個細胞組成，大小(18.5～25.0) μm×(4.5～6.2) μm，梭形或紡錘形，兩端細胞無色，倒錐形，中間3個細胞淺褐色至暗褐色，13.1～17.5 μm；分生孢子具4隔膜，分隔處稍縊縮，顏色亦深；分生孢子頂端著生2～3根附著絲，長9.0～17.8 μm，基部著生1根附著絲，長3.8～14.0 μm。根據以上形態學特征，鑒定該菌為擬盤多毛孢屬真菌(P.trachicarpicola)。

2.2 致病性測定

從圖2看出，將分離所得菌株SQ-20-1直徑6 mm的菌餅回接至刺傷的茶葉片上，3 d后可見明顯黑褐色病斑，隨后病斑擴大，7 d后病斑處產生分生孢子盤。刺傷接種PDA培養基餅的對照葉片在 7 d后僅出現機械損傷。將發病的茶樹葉片進行病原菌再分離，獲得的分離菌株與原病原菌株形態特征一致。因此，根據柯赫式法則可以確定，供試菌株SQ-20-1是引起茶輪斑病的病原菌。

2.3 分子生物學鑒定

對分離所得菌株SQ-20-1的DNA的ITS、tef1及β-tubulin序列進行PCR擴增和測序，獲得長度分別為526 bp、552 bp和460 bp的片段。利用NCBI中BLAST進行同源性比對，菌株SQ-20-1與P.trachiaarpicola具有較高同源性，二者ITS、tef1、β-tubulin序列的同源性分別達99.8%、100%

和100%。聯合ITS、β-tubulin及tef1共3個基因片段構建最大簡約/最大似然樹形圖(圖3)，供試菌株SQ-20-1與P.trachicarpicola(菌株號OP068、MFLUCC 12-0264、MFLUCC 12-0265、MFLUCC 12-0267)聚集為1支，自舉支持率高達66/97。因此，結合形態學和分子生物學特征，確定菌株SQ-20-1為棕櫚擬盤多毛孢(P.trachicarpicola)。

3 結論與討論

擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)是一種常見且分布廣泛的植物病原菌，可引起多種植物病害，如小孢擬盤多毛孢(P.microspora)可引起核桃、白術葉枯病[24-25]；P.Neglecta引起樟子松針黑斑病[26]；棒形孢擬盤多毛孢(P.clavispora)可引起藍莓葉斑病[27]；茶擬盤多毛孢(P.theae)可引起茶輪斑病[28]；棕櫚擬盤多毛孢(P.trachicarpicola)可引起葡萄枝干病害和果實軟腐病[29]。對于擬盤多毛孢屬的分類地位，在傳統的分類鑒定中，僅依據形態特征和ITS單基因序列對其分析鑒定[30]。MAHARACHCHIKUMBUR等[31]研究發現，ITS基因無法很好地區分擬盤多毛孢屬內的近似及其親源種，聯合ITS、β-tubulin和tef1基因可有效區分屬內種的親源關系；聯合此3個基因構建系統發育樹，對擬盤多毛孢屬的分類地位進行修訂，并從此屬內劃分出新擬盤多毛孢屬和假擬盤多毛孢屬真菌。

該研究通過單孢分離、菌株純化及致病性試驗，結合形態學分析及聯合ITS、β-tubulin和tef1基因的分子生物學分析確定，從茶樹病斑處分離得到的菌株為棕櫚擬盤多毛孢(P.trachicarpicola)，且其是引起茶輪斑病的病原菌。