蚯蚓腸道細菌生態功能及毒理學研究進展

晁會珍，孫明明,*，朱國繁，葉茂，張勝田，劉滿強，胡鋒

1. 南京農業大學資源與環境科學學院，土壤生態學實驗室，南京 210095 2. 合肥工業大學資源與環境工程學院，地下水實驗室，合肥 230009 3. 中國科學院南京土壤研究所，土壤環境與污染修復重點實驗室，南京 210008 4. 生態環境部南京環境科學研究所，國家環境保護土壤環境管理與污染控制重點實驗室，南京 210042

蚯蚓腸道中富含大量內生細菌，腸道中每克干重需氧菌和厭氧菌的數量大約是土壤中的12倍～40倍和10倍～4 000倍，它們不僅對蚯蚓自身新陳代謝及機能穩定具有重要調節作用，而且還有利于蚯蚓對土壤中有機物質的分解及養分元素(碳、氮和磷)的轉化[1-2]。蚯蚓腸道是接近于厭氧狀態的微環境，其中，內生細菌群落主要來源于土壤，但與土著細菌群落結構和組成因環境的不同而存在顯著差異[3]。由于特殊的生境體系，蚯蚓腸道細菌群落具有富集碳、氮和磷元素的能力，其含量約為土壤的2倍～5倍，這使得蚯蚓腸道細菌在促進土壤中有機污染物、微塑料和抗生素的降解以及重金屬的解毒過程中發揮了重要作用[4]。但是，過量污染物的存在也會對蚯蚓自身免疫系統及腸道細菌的群落多樣性產生負面影響。因此，進一步探明蚯蚓腸道細菌群落結構和功能多樣性的特征規律，挖掘蚯蚓腸道細菌環境功能潛力，對于促進農業生產及污染土壤可持續修復治理具有重要的理論和現實意義。

1 蚯蚓腸道細菌群落組成(Bacteria community in earthworm gut)

蚯蚓通過吞食土壤而攝入的土著菌群，其結構會隨著腸道的運轉和發酵發生變化；后期蚯蚓又通過排出蚓糞等方式改變土壤細菌群落，這就使土壤、蚯蚓腸道和蚓糞中的細菌群落既相互聯系又有一定的區分度[5]。蚯蚓腸道細菌群落組成對蚓糞的產出速率和質量有重要的影響，而蚓糞中細菌的種類和數量是抑制土傳病害、緩解土壤污染物毒害的關鍵因素[6]。因此，探明3種介質中細菌群落結構的內在關聯和差異能夠為土壤養分管理及蚓糞的品質的提升提供科學依據。

1.1 蚯蚓腸道細菌群落組成特點

蚯蚓腸道是蚯蚓消化系統最重要的器官之一，腸道為厭氧環境，且pH接近于中性(6～7)[4,7]，因而，蚯蚓腸道優勢細菌通常是在厭氧或兼性厭氧條件下可以生存的特殊菌群，例如：變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)[8]；同時內生菌群的結構組成也會隨著蚯蚓種類、生活習性和周邊土壤生境特征發生動態變化。Knapp等[9]對粉正蚓(Lumbricusrubellus)的腸道菌群進行檢測，該蚯蚓取自阿爾卑斯山脈中部的高山牧場，并且在牛糞中喂養6周后，利用聚合酶鏈反應-變性梯度凝膠電泳技術檢測發現變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、疣微菌門(Verrucomicrobia)和放線菌門為腸道優勢菌群，在腸道總細菌群落的豐度占比分別為36%、20%、17%、10%和3%(表1)；Pass等[3]利用16S rRNA焦磷酸測序技術對砷污染地區粉正蚓的腸道細菌群落進行檢測，發現該蚯蚓腸道中以變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和酸桿菌門(Acidobacteria)為優勢菌群，豐度分別為總細菌群落的50%、30%、6%和3%(表1)。Meier等[10]利用高通量技術檢測到草地中陸正蚓(Lumbricusterrestris)的腸道優勢菌群分別為變形菌門(30%)、放線菌門(28%)、軟壁菌門(Tenericutes)(13%)、綠彎菌門(Chloroflexi)(7%)、浮霉菌門(Planctomycetes)(7%)和疣微菌門(4%)(表1)。愛勝蚓屬(Eisenia)是一類分布較為廣泛的蚯蚓，因其生活周期短、繁殖力強和易于飼養等特點，被應用于許多研究。Wang等[11]為探究牛糞堆肥中赤子愛勝蚓(Eiseniafetida)的腸道細菌組成，利用高通量技術檢測出蚯蚓腸道菌群共有24個門，優勢菌群豐度由大到小分別為變形桿菌(50%)>軟壁菌門(33%)>放線菌門(9%)>擬桿菌門(7%)(表1)；Singh等[12]用木質纖維素生物基質喂養赤子愛勝蚓(Eiseniafoetida)和Perionyxexcavates30 d后，利用宏基因組測序技術分析2種蚯蚓腸道細菌群落組成，發現2種蚯蚓腸道細菌均以厚壁菌門為優勢菌，疣微菌門和綠彎菌門只在赤子愛勝蚓中檢出，而螺旋體門僅在Perionyxexcavates腸道內檢測出(表1)。周艷玲等[13]對峨眉山秉氏環毛蚓(Pheretimacarnosa)腸道的可培養細菌進行分離培養，發現細菌全部屬于厚壁菌門、變形菌門和放線菌門，豐度分別為68%、29%和3%(表1)。因此，蚯蚓腸道細菌群落的種類和豐度隨著蚯蚓的品種和外界環境等多因素發生相應的變化，且變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門通常是蚯蚓腸道中主要的優勢菌群。

1.2 蚯蚓腸道和土壤細菌群落組成差異

土壤是蚯蚓掘穴、攝食、消化和排泄的場所，為蚯蚓的生存提供了適宜的條件；同時，蚯蚓也通過自身活動改善土壤結構、提高土壤通透性、參與土壤能量傳遞和物質循環等。土壤是相對開放的空間，受外界擾動較大，氧氣含量、土壤含水量、pH值以及養分隨著土壤質地的改變而變化；相較于土壤，蚯蚓腸道的厭氧環境和高含量的碳、氮則給內生細菌的定殖和存活提供了一個相對穩定的空間。芽孢桿菌屬(Bacillus)和梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)是土壤中常見的細菌，但是其在土壤中的數量通常比蚯蚓腸道低，主要是因為腸道中高含量的氨基酸和糖底物能刺激它們的定殖和增殖，因此，當芽孢桿菌屬和梭狀芽胞桿菌屬的細菌進入蚯蚓腸道后，數量和活性均會顯著增加[14]。一些厭氧或兼性厭氧菌，如葡萄球菌屬(Staphylococcus)、氣單胞菌屬(Aeromonas)在蚯蚓腸道中的生存能力也相應增強[15]。此外，如表1所示，蚯蚓腸道、土壤及蚓糞中細菌群落組成具有一定的同源性，然而在門的水平的相對比例上有一定差異。Montagna等[16]利用高通量檢測技術發現阿爾卑斯山脈原狀土壤中，變形菌門的相對豐度為15%，未檢測到厚壁菌門；而在同地區的粉正蚓腸道中，變形菌門的相對豐度高達36%，厚壁菌門的相對豐度為20%[9](表1)；指出該地區土著蚯蚓對于土壤中變形菌門和厚壁菌門具有親和性和共生關系。Liu等[17]將秉氏環毛蚓放置在黃棕壤中培養10 d后，發現蚯蚓腸道變形菌門的相對豐度為45%，而土壤中變形菌門的豐度只占22%，并且還檢測到蚯蚓腸道中厚壁菌門的比例大于黃棕壤，相對豐度分別為42%和2%(表1)。Navrátilová等[18]利用高通量技術分析草地土壤中細菌群落組成，發現土壤中的放線菌門(8%)為優勢菌群，豐度比例明顯小于草地中粉正蚓腸道放線菌門(30%)(表1)。然而，并不是所有細菌均能適應蚯蚓腸道環境。Pass等[3]在研究砷對粉正蚓體內微生物組影響時發現，酸桿菌是土壤微生物主要的群落組成之一，占總數的35%，但在同一地區發現蚯蚓腸道中的酸桿菌門只有總數的3%(表1)；Liu等[17]同樣發現蚯蚓腸道中酸桿菌門的數量小于土壤，豐度分別為1%和31%(表1)；Naether等[19]在探究不同環境因子對酸桿菌的影響時，發現該類菌在土壤養分缺乏的環境能生長良好，且有與碳、氮含量呈負相關的趨勢，而蚯蚓腸道碳、氮含量往往是土壤的2倍～5倍，這可能是導致土壤中酸桿菌數量高于蚯蚓腸道的原因。因此，土壤和蚯蚓腸道細菌群落組成差異主要來源于二者環境的不同，且蚯蚓腸道中的厭氧或兼性厭氧菌的數量普遍高于土壤。

1.3 蚯蚓腸道和蚓糞中細菌群落組成差異

蚯蚓糞是自然界中多種有機廢棄物經發酵后，在蚯蚓體內消化酶系統的綜合作用下，迅速分解轉化而成的一類環境友好型高效養分有機肥資源。因此，蚓糞中細菌群落的組成和蚯蚓腸道內生菌群有著密不可分的關系。由于蚯蚓腸道更加適合厭氧或兼性厭氧菌的生存，所以細菌經過腸道運轉后，蚓糞中厭氧菌的數量高于原始基質[20]。Koubová等[5]將安德愛勝蚓(Eisentiaandrei)放入由牛糞、稻草桿和有機廢棄物組成的基質中進行飼養，并利用聚合酶鏈-變性梯度凝膠電泳技術，對基質、蚯蚓腸道及蚓糞中細菌群落進行檢測，發現在基質中厚壁菌門豐度為總細菌群落的19%，而蚯蚓腸道和蚓糞中厚壁菌門的豐度比例分別達到63%和36%(表1)。Huang等[20]以果蔬殘余和赤子愛勝蚓進行堆肥，利用定量聚合酶反應-變性梯度凝膠電泳技術對蚓糞中的細菌群落進行檢測，發現蚓糞中厚壁菌門豐度高于原始基質。另外，通過蚯蚓腸道的運轉，可能會使腸道和蚓糞中革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的比例發生改變。Villar等[21]將安德愛勝蚓和污泥進行堆肥，并利用磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid analysis, PLFAs)分析蚓糞細菌群落的組成，發現經過腸道后，革蘭氏陽性菌的數量會減小，進而造成蚓糞中革蘭氏陽性菌/革蘭氏陰性菌的比例減小。蚓糞細菌群落的組成還受到基質種類的影響。Aira等[22]分別以馬糞、豬糞和牛糞為基質，添加安德愛勝蚓進行堆肥，后期利用16S rRNA焦磷酸測序和宏基因組測序檢測蚯蚓腸道菌群組成，結果顯示，以馬糞和牛糞為基質的蚓糞中變形菌門豐度最高，為總細菌豐度的82%和76%；以豬糞基質的蚓糞中厚壁菌門所占的比例最高，為57%。Wang等[11]利用高通量技術，對牛糞、赤子愛勝蚓以及牛糞和赤子愛勝蚓產出的蚓糞進行了細菌群落檢測，分別在牛糞、蚯蚓腸道和蚓糞中檢測到15、24和33個門，79、182和184個屬。因此，蚓糞細菌群落組成與蚯蚓種類及蚓糞基質具有密不可分的聯系，且通過蚯蚓腸道運轉后，蚓糞中厭氧菌的數量會有所增加，同時蚓糞中細菌群落通常具有比蚯蚓腸道內容物和原始基質更高的物種多樣性。

表1 蚯蚓腸道、土壤和蚓糞細菌群落組成(%)(門水平)Table 1 Bacteria community of phylum in earthworm gut, soil and cast (%)

2 蚯蚓腸道細菌對土壤中污染物的解毒作用(Detoxification of earthworm intestinal bacteria to soil pollutants)

近年來，隨著我國工農業的迅猛發展，重金屬、有機污染物、微塑料和抗生素等物質在土壤中的檢出率不斷增加，給場地土壤的污染治理、農業的安全生產及人體健康帶來較為嚴重的威脅，因此，找到安全、經濟和有效的治理方法尤為重要[23-25]。蚯蚓在土壤中廣泛分布，其腸道菌群可以通過生物降解、吸附轉化和生物積累等方式對環境中的污染物進行積累或降解，且不產生二次污染，有利于土壤生態系統的穩定及環境的可持續發展[26-29]。

2.1 蚯蚓腸道細菌對土壤中重金屬的解毒作用

蚯蚓作為陸地生態系統生物量最大的無脊椎動物，已被廣泛的應用于重金屬污染土壤的毒理學研究。蚯蚓之所以能夠在緩解重金屬毒害的過程中發揮作用，主要是因為其自身強大的代謝系統以及腸道內生菌群的參與[6]。已經有許多研究表明，可以在蚯蚓腸道中分離出具有重金屬抗性并能有效降低重金屬毒害作用的內生細菌。Biswas等[26]在土后腔環蚓(Metaphireposthuma)腸道中分離一株對二價銅離子和二價鋅離子具有顯著抗性的菌株，通過16S rDNA序列系統發育分析方法確定為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformiastrain KX 657843)；該菌株對二價銅離子和二價鋅離子的最大耐受濃度分別為8 mmolL-1和6 mmolL-1，而且在重金屬濃度為25 mg·L-1的LB培養基上培育72 h后，通過分泌胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)對金屬離子的絡合作用，使二價銅離子和二價鋅離子的濃度分別降低35%和54%。后期Biswas等[30]在土后腔環蚓中又相繼分離出3株具有抗二價銅離子和二價鋅離子的磷酸鹽增溶菌(Phosphate solubilizing bacteria, PSB)，分別為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegateriumstrain MF589715)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformiastrain MF589720)和溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticusstrain MF589716)，此類菌株可以增加磷酸鹽的溶解，促使土壤中磷酸根和金屬離子形成絡合物，以減輕金屬離子帶來的危害，同時對二價銅離子和二價鋅離子的最大耐受濃度范圍為2～6 mmolL-1。此外，蚯蚓腸道中豐度較高的假單胞菌屬(Pseudomonassp.)也具有固定金屬離子的能力。如惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)通過增加磷酸鹽的溶解使鉛離子轉化為鉛羥基磷灰石和磷氯鉛進而達到對鉛的固定，減小鉛離子帶來的危害[31]。Goswami等[32]將赤子愛勝蚓和Lampitomauritii置于鋅、砷和錳等重金屬脅迫的環境中，為緩解重金屬毒性，蚯蚓腸道細菌分泌大量的金屬硫蛋白，以實現對重金屬的吸附絡合(圖1)。代金君等[33]以重金屬污染土壤為基質培養1周后，在赤子愛勝蚓腸道中發現了分泌金屬β-內酰胺酶(β-lactamase)的細菌，如香味菌屬(Myroidessp.)和不動桿菌屬(Acinetobacter)，該細菌可以分泌金屬β-內酰胺酶對土壤中的鋅離子吸附絡合。因此，蚯蚓腸道細菌可以通過生物吸附、生物積累和生物轉化等方式緩解或降低重金屬對土壤生物的毒害作用[34-36]。

2.2 蚯蚓腸道細菌群落對土壤中有機污染物的降解作用

有機污染物是指以蛋白質、碳水化合物、脂肪和氨基酸等形式存在并對人類和環境造成危害的有機化學物質。其中，持久性有機污染物(persistent organic pollutants, POPs)，如多環芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)，因其具有難降解、高毒性和半揮發等特點，對生態環境的可持續發展產生了較大的負面影響。已有許多研究發現蚯蚓腸道細菌能夠有效降解環境中的有機污染物[37]。Verma等[27]在土后腔環蚓腸道中分離出一株可以降解硫丹的菌株RhodococcusMTCC 6716，該菌株在硫丹存在的情況下通過酶促反應，將硫丹降解為硫丹二醇和硫丹硫酸酯2種無毒的代謝產物，且15 d內菌株對硫丹的降解率高達97%(圖1)。Mudziwapasi等[38]通過16S rRNA技術在赤子愛勝蚓腸道中分離出具有降解4,4-滴滴涕(4,4-dichlorodiphenyltrichloroethane, 4,4-DDT)能力的紅球菌(Rhodococcus)和芽孢桿菌，該類菌株通過分泌4,4-DDT還原性脫鹵素酶將污染物降解為毒性更小的4,4-滴滴滴(4,4-1,1-dichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl) ethylene, 4,4-DDD)，并且降解率分別高達88%和85%；Singh等[12]利用宏基因組測序對赤子愛勝蚓和掘穴環爪蚓(Perionyxexcavatus)這2種蚯蚓的腸道微生物的功能和分類進行了研究，發現在赤子愛勝蚓腸道中有22%的細菌可以參與脫鹵過程，有4%和2%的腸道細菌可以降解氯酚和萘；在掘穴環爪蚓腸道中同樣發現了可以參與脫鹵過程的細菌，豐度為總細菌群落的17%。蚯蚓腸道低氧化還原電位及豐富的葡萄糖為發酵提供了可能，腸道中產甲烷菌群可以通過發酵生成甲烷，甲烷可以為厭氧微生物如假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)提供電子供體，促進甲基橙(methyl orange, MO)等有機污染物的降解[39]。因此，蚯蚓腸道菌群對土壤中有機污染物的解毒及共代謝降解具有巨大的潛力。

2.3 蚯蚓腸道細菌群落對土壤中微塑料的分解作用

微塑料是粒徑<5 mm的塑料固體顆粒，因其具有易吸附重金屬和有機污染物且難降解等特點，給環境治理帶來了較為嚴重的挑戰[23,40-41]。目前，已有研究報道，蚯蚓腸道是富集微塑料的重要場所，腸道內生細菌具有分解微塑料的能力。Lwanga等[28]在陸正蚓腸道中分離出放線菌門和厚壁菌門，并將其培養在密度值為1%(w/w)的低密度聚乙烯(low density polyethylene, LDPE)的環境中，21 d后檢測到細菌對低密度聚乙烯的降解率達到60%，粒徑減小34%～56%，降解產物主要是正十八烷、二十烷、二十二烷和二十三烷等(圖1)。短芽孢桿菌(Brevibacillusborstelensis)是蚯蚓腸道常見的細菌種類，在Hadad等[42]的研究中發現，短芽孢桿菌可降解低密度聚乙烯的CH2主鏈，并可將低密度聚乙烯作為碳源進行利用，30 d內使聚乙烯的分子量降低30%。芽孢桿菌因抗逆性較強可廣泛存在于土壤、水以及腸道等環境中，已有研究表明，芽孢桿菌是蚯蚓腸道的優勢菌[8,13]。Auta等[43-44]發現芽孢桿菌具有降解聚丙烯(polypropylene, PP)的能力，后期將其置于含有聚丙烯的培養基中，培養40 d后發現該菌株主要是通過分泌胞外酶破壞聚丙烯的表面，致使菌株進入空隙內部定殖生長，進而實現逐步分解聚丙烯的過程。然而，蚯蚓腸道菌群在降解微塑料的同時，微塑料也會對蚯蚓及其腸道菌群產生影響。Wang等[45]將加州腔蚓(Metaphirecalifornica)培養在聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PVC)濃度為2 000 mg·kg-1的土壤中28 d，通過高通量技術發現聚氯乙烯的存在降低了腸道中綠彎菌門和酸桿菌門的相對豐度。Lwanga等[46]將陸正蚓置于不同含量的低密度聚乙烯(<150 μm)污染土壤中培養60 d，發現在清潔對照土壤中蚯蚓的生長率為10 mg·worm-1·d-1，而添加了濃度為60%的低密度聚乙烯的污染土壤中，蚯蚓的生長率受到顯著抑制，生長率<0。Zhu等[47]將Enchytraeuscrypticus暴露在納米聚苯乙烯(nano-polystyrene)含量為10%的土壤中，后期蚯蚓體重明顯下降，而且腸道中根瘤菌科(Rhizobiaceae)和伊索菌科(Isosphaeraceae)的豐度分別下降6%和33%。因此，蚯蚓腸道細菌不但能減小微塑料的物理粒徑，還能對環境中的微塑料化學結構進行降解。但是當微塑料含量過高時，會降低蚯蚓自身的機能以及改變蚯蚓腸道細菌群落組成。

2.4 蚯蚓腸道細菌群落對土壤中抗生素的消減作用

抗生素是由微生物或高等動物產生的具有抗病原體或其他活性的一類次級代謝產物，由于抗生素的不規范使用，已經在很多畜禽養殖廠、河海漁廠和垃圾填埋場等熱點區域周邊土壤中檢測到多種抗生素的長期殘留，對人體健康和生態環境安全造成了潛在威脅[48-49]。微生物菌群共代謝強化降解是土壤中殘留抗生素去除的重要途徑[50]。蚯蚓腸道作為土壤中移動的厭氧微域，通過增加土壤中厭氧菌的數量、改變土壤細菌群落組成來消減土壤中殘留的抗生素。Cao等[29]將赤子愛勝蚓放置在土霉素(oxytetracycline, OTC)濃度為100 mg·kg-1的土壤中56 d，與未添加蚯蚓的土壤相比，蚯蚓的存在增加了土壤中黃桿菌科(Flavobacteriaceae)和假單胞菌屬的豐度，進而促進土霉素的降解；同時在添加蚯蚓的土壤中檢測到土霉素濃度下降至33 mg·kg-1，并伴有降解產物4-差向土霉素(4-epi-oxytetracycline, EOTC)和2-乙?；?2-甲酰氨基土霉素(2-acetyl-2-decarboxamido-oxytetracycline, ADOTC)的生成(圖1)。環境因子尤其是氧氣含量是蚯蚓腸道內生細菌和土壤菌群產生差異的重要原因[51]。蚯蚓通過排泄的方式將腸道內的細菌帶入土壤，造成周邊環境細菌群落發生改變，促進細菌對抗生素的共代謝，以達到對環境中抗生素消減的目的。假單胞菌和葡萄球菌是蚯蚓腸道中常見的細菌種類，已有研究發現，在污泥和土壤中分離出來的假單胞菌和葡萄球菌可以通過分泌酶(如：氨基糖苷類乙酰轉移酶(aminoglycoside phosphotransferase, APH)、氯霉素乙酰轉移酶(chloramphenicol acetyltransferase, CAT))修飾鈍化環境中的抗生素[52-55]。因此，蚯蚓腸道細菌具有較大的潛力降解或鈍化土壤中殘留的抗生素。此外，環境中過量的抗生素對蚯蚓本身及其腸道菌群也有一定的損傷。Ma等[56]用土霉素濃度為10 μg·g-1的菜地土壤將Enchytraeuscrypticus培養21 d，并利用高通量技術檢測到土霉素的存在降低了腸道中變形菌門的豐度(由48%下降到24%)、增加了浮霉菌門的豐度(由28%上升到47%)。Wang等[57]將赤子愛勝蚓培養在環丙沙星(ciprofloxacin, CIP)濃度為0～51 mg·kg-1的土壤中，15 d后發現蚯蚓超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)及抗壞血酸過氧化物酶(ascorbateperoxidase, APX)的含量均有提高，活性氧(reactive oxygen species, ROS)的過量產生導致羥基化蛋白質的氧化損傷。Li等[58]探究了不同濃度的環丙沙星對赤子愛勝蚓的影響，發現當環丙沙星的濃度為2 g·kg-1時，赤子愛勝蚓的繁殖能力下降到原先的1/6，躲避行為達到100%。因此，土壤中過量的抗生素對蚯蚓的生長繁殖及氧化防御系統具有較大的負面影響。目前已有較多的研究發現抗生素對蚯蚓具有毒害作用，但是關于腸道菌群對抗生素的降解機制仍有待進一步探究。

圖1 蚯蚓腸道細菌對土壤中污染物的解毒作用Fig. 1 Detoxification of earthworm intestinal bacteria to soil pollutants

3 蚯蚓腸道細菌對土壤物質循環的影響(The effect of earthworm intestinal bacteria on soil substance circulation)

土壤中物質循環是組成生物體的化學元素在土壤無機環境和生物群落之間的遷移、轉化及物質交換的過程，有利于物質的更新和生態系統的穩定。蚯蚓腸道獨特的原位條件為厭氧微生物提供了適宜的生存空間，腸道中的厭氧微生物對促進土壤碳、氮和磷等元素的循環具有重要的影響[59-60]。

氮循環是自然界中各種形態的氮相互轉化的過程，其中，固氮作用、硝化作用、反硝化作用和氨化作用是細菌促進氮循環的重要過程。有研究表明，蚯蚓腸道中富含大量與固氮、硝化、反硝化和氨化作用密切相關的細菌群落[51]。Hussain等[59]在赤子愛勝蚓腸道中發現2種固氮菌，經鑒定后為沙雷氏菌屬(Serratia)和芽孢桿菌屬，并且首次分離出具有固氮功能的抗壞血酸克呂沃爾氏菌(Kluyveraascorbata)。Wüst等[61-62]發現陸正蚓后腸排放氧化亞氮的能力高于前腸和中腸，亞硝酸鹽的含量則呈現相反的趨勢，隨后對蚯蚓腸道不同位置的內生細菌進行了分析，發現后腸中反硝化細菌(denitrifying bacteria, DNB)群落物種多樣性顯著高于前腸和中腸反硝化細菌的群落，同時證實不同種類的蚯蚓(粉正蚓、Aporrectodearosea、Octolasioncyaneum和Octochaetusmultiporus)均能排放氧化亞氮(圖2)。Depkat-Jakob等[63]通過對編碼硝酸還原酶的基因(narG)、編碼亞硝酸還原酶的基因(nirK)和編碼氧化亞氮還原酶的基因(nosZ)的序列進行焦磷酸測序，發現蚯蚓腸道中存在的反硝化菌主要來自于攝入的土壤菌群，其中占主導地位的為根瘤菌目(Rhizobiales)，證明土壤中根瘤菌的存在是蚯蚓排放氧化亞氮的重要原因之一。氨氧化菌是硝化作用的主要參與者，可以將氨氧化為硝酸[64]。在Singh等[12]的研究中，分別在赤子愛勝蚓和掘穴環爪蚓腸道中檢測出24%和14%的氨氧化菌，同時，還在2種蚯蚓腸道中檢測到固氮菌(7%和2%)、亞硝酸鹽還原菌(15%和9%)的存在。因此，蚯蚓腸道內生菌群是土壤氮循環的重要驅動因素。

細菌通過碳固定和甲烷代謝等過程參與土壤中的碳循環，對全球氣候變化和陸地生態系統的穩定有著重要的作用。蚯蚓腸道是富含糖類的厭氧環境，給腸道細菌進行產甲烷反應創造了便利的條件，對土壤碳循環有一定的促進作用[65]。Depkat-Jakob等[65]通過對甲基-CoM還原酶相關的基因(mcrA)轉錄后進行系統發育分析，發現Eudriluseugeniae具有排放甲烷的能力是因為腸道中含有球菌科(Methanosarcinaceae)、甲烷菌科(Methanobacteriaceae)和甲烷微菌科(Methanomicrobiaceae)等細菌；這些細菌可以參與腸道中的葡萄糖發酵，生成甲烷并伴有二氧化碳的產生，進而促進碳的循環[60](圖2)。此外，蚯蚓還可通過加快有機質的分解實現對碳的轉化。姜炳棋等[66]利用14C示蹤技術，探究了威廉腔環蚓(Metaphireguillelmi)對14C-土壤有機質轉化的研究，結果表明，蚯蚓腸道對有機質的轉化有著顯著影響，并發現蚯蚓腸道內生細菌對于原始有機質的礦化具有促進作用，同時對礦化后的有機質殘留物有穩定化作用。蚯蚓腸道細菌不但可以礦化有機質，還通過腸道糖發酵產生二氧化碳和甲烷實現對碳的轉化，對土壤的碳循環具有積極的影響。

土壤中95%～99%的磷是難溶性的，只有通過無機磷酸鹽的溶解和有機磷酸鹽的礦化之后才能轉化為可利用的形態[67]。有研究表明，蚯蚓腸道細菌具有溶解無機磷酸鹽、增加有效態磷的能力[30,59]。Biswas等[30]在土后腔環蚓腸道中分離出3株具有溶解磷酸鹽的細菌，經鑒定后分別為Bacillusmegateriumstrain MF 589715、Staphylococcushaemolyticusstrain MF 589716和Bacilluslicheniformisstrain MF 589720；將這3種菌置于營養瓊脂培養基上培養96 h后，分別產生214、194和222 mg·L-1的可溶性磷酸鹽，被視為可溶性磷酸鹽的潛在供體，具有非常高的利用價值(圖2)。另外，Hussain等[59]發現赤子愛勝蚓腸道中有溶磷菌的存在，如沙雷氏菌屬、芽孢桿菌屬，能將堆肥中的可利用磷含量由初始的46 mg·kg-1上升到215 mg·kg-1(第60天)。Sahariah等[68]的研究表明，蚯蚓腸道細菌能溶解磷酸鹽是因為部分細菌能分泌磷酸酶(phosphatase)，將磷酸酯轉化為無機磷。因此，利用蚯蚓腸道細菌溶解磷酸鹽是增加磷可利用態的有效途徑之一。

4 蚯蚓腸道細菌群落的功能基因多樣性(Functional gene diversity of earthworm intestinal bacterial communities)

反硝化作用是土壤生態系統中氮元素循環轉化的重要途徑，在厭氧環境中可以利用硝酸鹽還原酶(nar)、亞硝酸還原酶(nir)和一氧化亞氮還原酶(nos)等逐步還原硝酸鹽和亞硝酸鹽，最終生成含氮氣體的過程，因此，nirS、nirK、narG和nosZ等基因豐度波動情況可以反映反硝化菌的活性和數量變化[69-70]。Kotzerke等[69]為探究磺胺嘧啶(sulfadiazine, SDZ)對赤子愛勝蚓腸道反硝化菌的影響，將蚯蚓喂養在被磺胺嘧啶污染的環境中，2周后檢測到蚯蚓腸道中的nirK和nirS的豐度降低近一個數量級，進而得出磺胺嘧啶對腸道中的反硝化菌的活性存在抑制作用；Depkat-Jakob等[70]對粉正蚓和陸正蚓腸道內容物中narG和nosZ進行轉錄和系統發育分析，發現腸道和土壤上層的narG轉錄物與放線菌門有較高的同源性，同時蚯蚓腸道和土壤中nosZ的轉錄物與變形菌門具有較高的同源性。因此，得出腸道中反硝化菌源自土壤，并且絕大多數屬于放線菌門和變形菌門。蚯蚓腸道中的厭氧發酵菌(anaerobic fermentation bacteria, AFB)在[NiFe]和[FeFe]2種氫化酶的作用下參與發酵并產生氫氣。因此，對[NiFe]和[FeFe]2種氫化酶轉錄物進行多樣性分析可以推測腸道中厭氧發酵菌群[71](圖3)。Schmidt等[71]分別對陸正蚓腸道中2種氫化酶的轉錄物進行系統發育分析，發現178個[FeFe]轉錄物中有177個與梭菌目(Clostridiales)相關，而84個[NiFe]轉錄物中，79%與腸桿菌科(Enterobacteriaceae)有關。因此，得出梭菌目和腸桿菌科是腸道中活躍的發酵群。Wang等[72]對Metaphiresieboldi腸道中砷生物轉化基因(arsenic biotransformation genes, ABGs)進行了定量，發現在16個砷生物轉化基因中，絕大多數為砷外排基因和砷氧化還原基因，進而得出蚯蚓腸道砷生物轉化細菌(arsenic biotransformation bacteria, ABB)主要通過砷外排和氧化還原來減輕砷的毒害(圖3)。此外，當蚯蚓受到外來污染物侵染，并且細胞受到氧化傷害時，為了抵御這種氧化應激(oxidative stress, OS)，蚯蚓會通過調控一些功能基因的表達來維持自身機能的穩定，例如，調控超氧化物歧化酶相關的基因(sod)和谷胱甘肽S-轉移酶相關的基因(gst)[73]。Shi等[74]將赤子愛勝蚓培養在含400 mg·kg-1六溴環十二烷的土壤中，14 d后發現蚯蚓體內sod和gst表達量分別是對照組的2倍和4倍。另外，蚯蚓還可以通過解毒基因削弱污染物帶來的負面效應，例如，編碼細胞色素P450的基因(CYP450)。Li等[75]發現當恩諾沙星的濃度為1 mg·kg-1時，CYP450表達量是對照的2倍，蚯蚓的解毒能力得以提升；而當恩諾沙星的濃度為100 mg·kg-1時，基因表達僅為對照的一半，蚯蚓的解毒能力受到了抑制，因此，CYP450的表達狀態可以作為蚯蚓解毒能力的指示參考。綜上，蚯蚓腸道功能基因的豐度變化不但能用來指示腸道功能細菌結構、數量、功能及活性，而且還可以作為化學物質對蚯蚓毒理學作用的重要指標。

圖2 蚯蚓腸道細菌對土壤物質循環的影響Fig. 2 The effect of earthworm intestinal bacteria on soil substance circulation

圖3 蚯蚓腸道細菌群落的功能基因多樣性Fig. 3 Functional gene diversity of earthworm intestinal bacterial communities

5 總結與展望(Conclusion and prospect)

近年來關于蚯蚓腸道微生物群落組成的研究受到了越來越多的關注，然而針對蚯蚓腸道功能細菌及功能基因的研究還相對較少，仍有一些關鍵科學問題需要闡明。(1)蚯蚓腸道菌群對土壤中污染物的降解與解毒機制。目前，已有較多研究表明，蚯蚓在促進污染土壤的生態修復過程中扮演了重要的作用，但是關于蚯蚓腸道內生細菌對有機污染物的降解及重金屬毒害的解毒機制仍有待進一步探明。(2)蚯蚓腸道細菌功能基因的耦合作用機制。蚯蚓腸道細菌的生態功能與其功能基因的表達密不可分，目前，已有研究對蚯蚓腸道內的硝化基因、反硝化基因和產甲烷基因賦存規律及表達特點進行研究，然而針對腸道中有機污染物降解基因、抗生素抗性基因和重金屬解毒基因的報道卻相對較少，特別是針對不同功能基因之間的耦合作用機制，都是值得深入探究的科學問題。(3)蚯蚓腸道微生物組在土壤物質循環的作用機制。蚯蚓腸道微生物組囊括了內生細菌群落結構、組成與功能多樣性和穩定性的綜合特征，同時也包括腸道微生物群落中關于養分元素吸收、轉運、同化和異化作用等系列功能基因的表達，這些都會直接影響蚯蚓對不同類型碳、氮、磷和硫等元素的轉化過程，進而間接影響土壤物質元素循環的周轉速率、遷移途徑與賦存形態，因此，蚯蚓腸道微生物組在土壤物質循環的作用機制仍是今后關注的研究熱點。