蚯蚓生物標志物在土壤生態系統監測中的應用研究進展

郭佳葳，周世萍，劉守慶，李惠娟，楊發忠，朱國磊

西南地區林業生物質資源高效利用國家林業與草原局重點實驗室(西南林業大學)，昆明 650224

美國環境保護局發布的相關生物標志物的報告中，將生物標志物歸納為：穿過機體屏障并進入生物組織或體液的環境污染物或其產生的生物效應，對它們的檢測結果可作為生物體暴露、效應及易感性的指示物[1]。在土壤生態系統中，毒性物質的半衰期相對較長，污染物暴露的持續時間也較長，因此，生物標志物的應用價值主要在于，能夠表達其與土壤中污染物生物可利用性的相關性，能為土壤所受到的實際危害提供更準確的評估。目前，生物標志物作為早期預警系統或污染危害的準確測量的有效工具，已普遍用于土壤污染的生態毒理學診斷，可為土壤污染預防和修復提供準確依據[1-2]。

蚯蚓是土壤中生物量最大的無脊椎動物，在土壤生態系統循環中起著重要作用。同時，它也是陸地生態系統食物鏈中的一員，在農田生態系統物質循環和能量流動中起著重要作用。正是由于這些獨特的生物學功能，蚯蚓已經被許多學者作為土壤環境污染狀況評價的指示生物之一，利用蚯蚓生物標志物進行土壤生態風險評價[3]。蚯蚓用于土壤污染的生物標志物主要分為以下幾類：個體及種群水平的生物標志物、細胞水平的生物標志物、生物酶蛋白標志物以及暴露和生物效應標志物。

1 個體及種群水平的生物標志物(Biomarkers at individual and population levels)

1.1 個體及種群水平的生物標志物種類

個體及種群水平的生物標志物主要是指在一定劑量的污染物暴露條件下，蚯蚓個體或種群出現的生物反應指標[1]。個體及種群水平的生物標志物主要有：行為形態指標、繁殖指標和生長指標等。

行為、形態指標主要有蚯蚓的體型、質量和顏色的變化，有無環節松弛、潰爛甚至脫節現象，有無行為上的扭動、卷曲或麻痹狀態，以及是否死亡等。

繁殖指標主要包括精子畸變率、產卵率和蚓繭孵化率。生殖系統是對外源化合物反應最敏感、最容易遭受不良環境因素影響的系統。外源污染物進入蚯蚓體內，蚯蚓的細胞組織結構遭到破壞，產卵能力和精子形成過程受到影響[4]。

污染物在蚯蚓體內的富集量也是重要的生物標志物指標。蚯蚓富集土壤中的污染物主要通過2種方式：被動擴散作用和攝食作用。前者是污染物從土壤溶液透過體表進入蚯蚓體內；后者是污染物由蚯蚓吞食，然后在內臟器官內完成吸收[4]。到目前為止，已經有許多學者研究了個體及種群水平的生物標志物，將有代表性的研究結果總結于表1中。

1.2 個體及種群水平的蚯蚓生物標志物在土壤生態系統監測中的應用

土壤污染物種類眾多，這里主要就個體及種群水平的蚯蚓生物標志物，在土壤有機污染物和重金屬污染物的監測應用進行評述。

1.2.1 有機污染物

目前，采用個體及種群水平的蚯蚓生物標志物對土壤有機污染物進行生態監測的研究較多。Capowiez等[5]研究發現，將2種蚯蚓放在添加吡蟲啉的土壤中，2種蚯蚓的行為能力(蚯蚓掘洞的長度、洞穴覆蓋的范圍以及洞穴再利用率)均出現明顯的下降。Espinosa-Reyes等[6]研究發現，赤子愛勝蚓(Eiseniafetida)暴露在2 mg·kg-1呋喃丹污染的土壤中，既無環帶發育，也不能產卵。Mosleh等[7]研究發現，蚯蚓對涕滅威的富集因子為0.05～0.15，對硫丹的富集因子為0.48～0.85，但是，如此小的富集因子也能對蚯蚓的生長速率、死亡率和蛋白質含量產生較大影響。段曉塵[8]研究了多氯聯苯對赤子愛勝蚓的生態毒理效應，發現暴露時間和土壤性質顯著影響蚯蚓體重的變化率。崔小維[9]研究了溴氰菊酯、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯污染對蚯蚓種群的影響，發現溴氰菊酯(0～10 mg·kg-1)和鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(0～150 mg·kg-1)在75 d的培養周期內對成蚓的數量沒有明顯影響，而對幼蚓的數量有顯著的影響。溴氰菊酯污染情況下，幼蚓的數量隨染毒濃度的升高顯著降低；鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯污染情況下，當染毒濃度為1～5 mg·kg-1時，幼蚓數量顯著提高，各濃度間幼蚓數量沒有顯著差異，當染毒濃度為10～150 mg·kg-1時，幼蚓數量較對照顯著下降，各濃度間幼蚓數量沒有顯著差異。

1.2.2 重金屬

應用個體及種群水平的蚯蚓生物標志物，對土壤重金屬污染物進行生態監測也是近年來的研究熱點。張露等[10]研究了褐潮土中外源鎳對蚯蚓的生殖毒性效應，發現在濃度>180 mg·kg-1時，蚯蚓生殖系統受到較強的毒性侵害，產繭量明顯降低。邢宇翚等[11]研究了蚯蚓對有機肥中鎘、鉻和鉛的富集作用，發現蚯蚓對重金屬復合污染的牛糞中的Cd2+、Cr3+和Pb2+重金屬離子均有生物富集作用。Calisi等[12]的研究表明，污水處理廠中的銀納米粒子和硝酸銀均會抑制蚯蚓的繁殖，影響其生長。楊曉霞等[13]將赤子愛勝蚓暴露于亞致死劑量汞污染土壤中4周，以蚯蚓個體(致死率、體重增長率)及小分子代謝物(代謝組)為指標研究其對汞的動態毒性響應，結果表明，蚯蚓對汞的吸收尚未達到穩態，蚯蚓體內代謝物的響應依賴于暴露劑量及暴露時間。向昌國和李文芳[14]研究了鋅污染對常見土壤動物白頸環毛蚓(Pheretimacalifornica)呼吸代謝的影響。結果表明，白頸環毛蚓體表接觸Zn2+造成鋅中毒后，其呼吸強度明顯下降，且下降程度隨Zn2+濃度的增加和歷時的延長而加大，高濃度或長時間染毒都能導致蚯蚓的死亡。

表1 蚯蚓個體及種群水平的生物標志物Table 1 Biomarkers at individual and population levels of earthworms

表2 蚯蚓亞個體水平的生物標志物Table 2 Biomarkers at sub-individual level of earthworms

2 亞個體水平的生物標志物(Biomarkers at the sub-individual levels)

目前，在土壤生態系統監測中應用的蚯蚓亞個體水平的生物標志物主要有：細胞水平的生物標志物、生物酶和生物蛋白標志物以及暴露和生物效應標志物等，其主要的研究進展總結于表2中。

2.1 細胞水平的生物標志物

2.1.1 細胞水平的的生物標志物種類

細胞水平的生物標志物是蚯蚓暴露于亞致死劑量的外源污染物條件下，其細胞結構或功能指標發生異常變化的信號指標。主要包括溶酶體膜的穩定性、DNA損傷[1]、免疫功能和大分子加合物。

蚯蚓體腔細胞內的溶酶體能很快積累中性紅染料，當受到環境脅迫時，膜的滲透性增高，穩定性降低，染料就逐步泄露到細胞質中，因此，可通過中性紅試驗的中性紅保留時間(NRRT)來表征溶酶體膜的穩定性。溶酶體膜的穩定性與污染物的劑量具有很好的線性關系，可以對土壤污染狀況作出早期預警[4]。

DNA是生物體內重要的遺傳物質，外源污染物對蚯蚓DNA的損傷已經成為蚯蚓分子生態毒理學的一項重要研究內容。目前，研究污染物對蚯蚓DNA的損傷作用主要是通過單細胞凝膠電泳技術，即“彗星試驗”來完成[4]。

在長期的進化過程中，蚯蚓為了適應不利的生存環境，體內產生了獨特的抗菌和免疫系統，并漸漸形成了防御病原細菌侵襲的有效機制[4]。

大分子加合物是反映靶細胞分子內接觸劑量的生物標志物，主要包括蛋白質加合物和DNA加合物兩大類。DNA加合物既可以作為接觸生物標志物來反映毒物到達靶位的接觸劑量，又可以作為一種效應標志物，反映DNA受到有毒化學物質損傷的效應劑量[2]。

2.1.2.1 有機污染物

應用細胞水平的蚯蚓生物標志物，對土壤有機污染物進行生態監測的研究較多。馮磊等[36]研究了3種新煙堿類農藥對蚯蚓溶酶體膜的影響，結果表明，3種藥劑對體腔細胞溶酶體膜穩定性有影響，對溶酶體膜的毒性作用隨著藥劑濃度增加和暴露時間延長而增強。Rajaguru等[37]利用單細胞凝膠電泳技術檢測了印度河中污染物對蚯蚓的遺傳毒性效應，結果表明，蚯蚓體腔細胞長寬比升高較為顯著。王作彬[38]研究了吡唑醚菌酯和氟嘧菌酯對蚯蚓的DNA損傷，發現經吡唑醚菌酯和氟嘧菌酯染毒處理后，蚯蚓體腔細胞DNA受到了明顯的損傷。32P-后標記法測定赤子愛勝蚓暴露于多環芳烴1～2周后，DNA加合物含量升高[39]。盧杰等[40]評價了珠三角地區印染污泥中多環芳烴的生態風險，發現印染污泥對蚯蚓體腔細胞溶酶體中性紅停留時間抑制率在污泥濃度為100 g·kg-1時達到25.4%，在400 g·kg-1時達到96.8%。馬嵩[41]研究錢塘江沉積物中多氯聯苯污染特征時，采用了蚯蚓體腔細胞離體培養彗星實驗，結果表明，部分沉積物中混合有機污染物質對蚯蚓體細胞DNA會產生一定的損傷，表現出一定程度上的遺傳生物毒性。王軼[42]利用單細胞凝膠電泳技術研究莫能菌素染毒后對蚯蚓DNA的損傷，發現低濃度莫能菌素(10 mg·kg-1)沒有表現明顯的遺傳毒性，高濃度的莫能菌素(50 mg·kg-1)可以導致DNA的嚴重損傷，其最低可觀察效應濃度(LOEC)值為15 mg·kg-1，莫能菌素濃度的變化與DNA損傷的程度具有良好的劑量-效應關系。張清明[43]通過單細胞凝膠電泳技術研究低劑量氟磺胺草醚對蚯蚓的影響，發現施用前期(14 d)可以引起蚯蚓體腔細胞的DNA損傷，但是DNA損傷程度多為輕微損傷和中度損傷。隨著暴露時間的延長，在蚯蚓機體自我防御功能的保護下，氟磺胺草醚對蚯蚓的生態毒性逐漸消失。

2.1.2.2 重金屬

與有機污染物相比，應用細胞水平的蚯蚓生物標志物，對土壤重金屬污染物進行生態監測的報道相對較少。Hooper等[44]研究發現，當蚯蚓暴露在鋅污染環境中時，其免疫功能會受到抑制，并且會下降20%。李帥章等[45]對赤子愛勝蚓進行銅與砷染毒，發現黏附細胞吞噬活性與細胞吞飲作用受重金屬的影響而減弱，這說明，重金屬對蚯蚓中與免疫相關的體腔細胞影響較大。王秋麗等[46]研究了土壤鉛污染對細胞溶酶體膜的毒性效應，發現染毒6 d，溶酶體膜穩定性變化不大，染毒14 d，各染毒組溶酶體膜中性紅保留時間顯著低于對照組。

2.2 生物酶和生物蛋白標志物

2.2.1 生物酶和生物蛋白標志物種類

外源污染物可以使蚯蚓體內許多重要酶活性發生變化，許多學者已經將蚯蚓體內酶活性作為生物標志物指示土壤污染。目前，所研究的生物酶主要包括：細胞色素P450、谷胱甘肽轉移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)等。生物蛋白標志物主要為金屬硫蛋白。

細胞色素P450酶系作為生物體內的第一代謝階段酶，對外源有機化合物的代謝具有重要作用。GST、SOD和CAT均屬于抗氧化酶防御系統。在活性氧產生、轉化的過程中，CAT能去除過氧化氫；而SOD能消除超氧陰離子(O2-)。當這些抗氧化防御酶的活性受到抑制時，會導致氧自由基不能及時清除，造成活性氧的積累，引發膜的脂質過氧化，導致細胞損傷，降低生物的適應能力和健康水平，從而導致中毒反應[47]。金屬硫蛋白是一類廣泛存在于生物體內的低分子量、富含半胱氨酸的金屬結合蛋白[4]。

2.2.2 生物酶和生物蛋白標志物在土壤生態系統監測中的應用

2.2.2.1 有機污染物

遙感課程的考核評價由平時成績、作業成績和期末考試成績三部分組成，占比分別為20%、20%和60%。其中，平時成績主要通過考勤來考核，作業成績靠提交課后習題來考核，期末考試成績則是試卷分數。目前，對學生最終成績起決定性作用的還是期末考試成績，平時成績的認定仍停留在“上課了(學生聽與不聽，教師考核不了)，課后習題寫了(學生的創新技能考核不了)，平時成績就可以拿高分”的階段。這種考核評價方法沒有考慮到學生的學習過程，無法真實地體現學生對知識的消化程度和對實踐技能的掌握程度，不能反映學生的真實水平，也不能培養學生解決實際問題的能力。

對于有機污染物，蚯蚓生物酶和生物蛋白標志物的指示作用更加明顯。張薇等[48]研究了菲和芘對蚯蚓細胞色素P450和抗氧化酶系的影響，發現菲和芘在不同暴露濃度下對蚯蚓體內P450酶系具有一定的誘導作用，低劑量污染時即可觀察到這種響應，隨著暴露濃度的增加誘導效應增強。在乙基對硫磷、雙硫磷和丙溴磷對蚯蚓乙酰膽堿酯酶活性影響的研究中，發現這3種有機磷農藥對蚯蚓的抑制率達到了80%以上，其中，呈現此效應的最低濃度為120 ng·cm-1，且呈良好的劑量-效應關系[49-51]。馬麗麗等[52]研究了磷酸三甲苯酯(TCP)、磷酸-2-乙基己基二苯酯(EHDP)和磷酸三苯酯(TPP)3種污染物對蚯蚓的毒性效應，發現隨著TCP暴露濃度的增加，蚯蚓體內總SOD活性呈現先上升后逐漸下降的趨勢，隨EHDP和TPP濃度增加，SOD活性均被刺激而上升；TCP、EHDP和TPP脅迫下，蚯蚓體內CAT活性隨濃度增加呈現上升趨勢。胡雙慶[53]研究了多環芳烴菲和重金屬鉻復合脅迫對蚯蚓的分子毒理學效應，發現菲和鉻復合脅迫時蚯蚓體內SOD活性表現為先受到抑制而后逐漸恢復，再轉變為受到誘導作用，CAT活性表現為先被抑制而后被誘導。劉修園等[54]探究雙酰胺類殺蟲劑對赤子愛勝蚓的毒性作用，發現在染毒濃度為5.0 mg·kg-1和10.0 mg·kg-1的處理組中，蚯蚓體內活性氧(ROS)含量顯著高于其他處理組，過量的ROS誘導蚯蚓體內各種抗氧化酶活性發生異常變化。李德金[55]通過蛋白組學研究發現，蚯蚓體內胞外球蛋白等在一定程度上能夠反映氧化應激損傷對于細胞骨架和肌肉收縮活動的破壞，可成為抗生素污染土壤潛在的分子生物標志物。沈飛超[56]研究了鄰苯二甲酸二甲酯污染土壤中生長的蚯蚓表皮組織細胞蛋白質的表達差異，初步鑒定出5種差異蛋白質，有望成為土壤生態毒性評價、監測和開展毒理學研究的生物大分子標記物。

2.2.2.2 重金屬

蚯蚓生物酶和生物蛋白標志物也能夠有效地指示重金屬污染水平。曾燕燕等[57]探究了蚯蚓對設施菜地土壤重金屬的脅迫耐性響應機理，結果表明，重金屬低濃度長期脅迫及高濃度短期脅迫下蚯蚓體內細胞色素P450呈現應激上升，而高濃度長期脅迫下出現抑制下降趨勢，且隨重金屬脅迫劑量的增加，下降趨勢增強。丁龍等[58]研究了赤子愛勝蚓暴露于外源鎘污染土壤15 d后蚯蚓抗氧化酶的變化，結果表明，隨著土壤有效態的升高，SOD活性和CAT活性基本呈現先降低、后升高和再下降的變化。此外，Lukkari等[59]研究發現，鉛、鋅等重金屬也能誘導蚯蚓體內GST活性的變化。鄒海平[60]研究了重金屬對農田蚯蚓體內金屬硫蛋白和相關酶活性的影響，發現相同濃度下，Cr6+、Ag+對蚯蚓體內金屬硫蛋白含量起促進作用，而Cu2+起抑制作用，Cr6+比Ag+促進作用強。Mustonen等[61]把不同種群的蚯蚓暴露在不同濃度的銅、鋅污染中，發現污染物濃度越高，蚯蚓體內金屬硫蛋白含量越高。孔德洋和薛銀剛[62]研究了重金屬鎘污染對赤子愛勝蚓的自由基產生及抗氧化防御系統的影響，發現不同濃度鎘暴露能誘導赤子愛勝蚓產生·OH自由基，·OH自由基非常敏感，在低濃度組0.5 mg·kg-1時就出現顯著性誘導，蚯蚓產生氧化應激反應。

2.3 暴露和生物效應標志物

2.3.1 暴露和生物效應標志物種類

暴露和生物效應標志物與前面所描述的生物酶和生物蛋白標志物最大的不同在于，其分子反應不是直接與生物體的解毒機制聯系，而是與暴露效應有關。這類標志物中最著名的就是熱激蛋白(HSPs)。HSPs是由一系列不同分子量的蛋白譜系組成，是一類高度保守的蛋白。其中，廣泛利用的生物標志物是HSP70和HSP90[47]。污染物可誘導HSP70和HSP90濃度上升，通過對其測定可定量檢測環境污染物的生物效應[1]。

2.3.2 暴露和生物效應標志物在土壤生態系統監測中的應用2.3.2.1 有機污染物

蚯蚓暴露和生物效應標志物對有機污染物的指示在土壤生態系統監測中的應用也很普遍。王曉尉[63]研究了HSP70作為分子生物標志物在土壤氯代苯胺化合物污染評價中的應用，發現3,4-二氯苯胺處理后，蚯蚓HSP70表達增加，與空白對照組比較有顯著性差異。劉嫦娥[64]以赤子愛勝蚓為對象，模擬常規除草劑使用劑量，在室外模擬培養環境下研究了蚯蚓熱激蛋白HSP27和HSP40對各類除草劑的時間-效應和劑量-效應關系。結果表明，暴露于4種除草劑后，隨著處理時間的延長，HSP27和HSP40的表達強度較對照組先升高后降低。HSP27和HSP40對阿特拉津暴露最為敏感，然后依次為乙草胺、丁草胺和綠麥隆。蚯蚓體組織HSP27和HSP40對除草劑的響應曲線都呈現倒U型劑量-效應特征。目前，對于蚯蚓應激蛋白的研究方興未艾，它將會是一種較有發展潛力的生物標記技術。

2.3.2.2 重金屬

雖然，針對重金屬的暴露和生物效應標志物的研究較少，但已有研究成果具有很強的指向作用。曾燕燕[65]通過蚯蚓對重金屬鉛、銅和鎳的脅迫響應研究發現，重金屬低濃度長期脅迫及高濃度短期脅迫下蚯蚓體內熱激蛋白(HSP20和HSP90)均出現應激上升，而高濃度長期脅迫下出現抑制下降的趨勢，且隨重金屬脅迫劑量的增加，抑制下降趨勢增強。Homa等[66]認為熱激蛋白HSP72和HSP70可以用于金屬污染的敏感生物標志物。目前，蚯蚓體內熱激蛋白作為生物標志物的研究較少，大部分研究主要集中于貝殼類生物。貽貝(Mytilusspp.)暴露在污染海灘7 d后HSPs(MgHSC70和MgHSP70)表達量顯著改變[67]。牡蠣(Crassostreavirginica)暴露于不同溫度和重金屬鎘污染的河口帶，HSP69顯著上調，而HSC72～HSC77和HSP90在鎘暴露下表達量較低[68]。這些研究均對于蚯蚓體內熱激蛋白的研究具有指導作用。

3 總結與展望(Summary and prospect)

已有研究表明，蚯蚓不同水平層次的生物標志物均可以作為監測指標，對土壤污染物進行生態監測。例如，在個體及種群水平上，可以使用行為形態指標、繁殖指標和生長指標等作為生物標志物監測指標；在細胞水平上，可以使用溶酶體膜的滲透性、DNA損傷等作為生物標志物監測指標。此外，還有一些生物酶和生物蛋白標記物以及暴露和生物效應標記物，也可作為生物標志物監測指標。這些生物標志物在土壤有機污染物和重金屬污染物的生態監測應用中，具有以下特點。

(1)在土壤生態系統監測中，不同水平的蚯蚓生物標志物靈敏度具有極大差異，適用的條件也各有不同。一般來說，暴露和生物效應標志物、亞個體水平的生物標志物(如熱激蛋白、乙酰膽堿酯酶和抗氧化酶系)的靈敏度要高于個體及種群水平的生物標志物；個體及種群水平的不同生物標志物靈敏度也存在差異，產卵量、卵孵化率和生長率的靈敏度通常高于致死率。就應用條件而言，暴露和生物效應標志物、亞個體水平的生物標志物由于具有較高的靈敏度，通常可用于低劑量污染物的監測，而個體及種群水平的生物標志物主要用于大劑量的污染物監測，其中，產卵量、卵孵化率和生長率監測指標由于靈敏度相對較高，也可用于低劑量污染物的長期監測。

(2)筆者對搜集到的資料(表1和表2)進行整理發現，對于土壤有機污染物的生態監測，應用最多的監測指標為個體及種群水平的蚯蚓生物標志物，其研究報道所占比例為相關總文獻的57%，此類指標中應用最多的指標是生長率和產卵量。亞個體水平的蚯蚓生物標志物是僅次于個體及種群水平蚯蚓生物標志物的監測指標，此類指標中應用最多的指標主要是膽堿酯酶、抗氧化酶活性和中性紅保留時間，其余蚯蚓生物標志物作為監測指標的研究報道相對較少?？偟膩碚f，個體及種群水平的蚯蚓生物標志物是目前應用最多的土壤有機污染物監測指標，而亞個體水平以及暴露和生物效應標志物作為監測指標的應用不多，這主要是因為這類生物標志物不太穩定，容易受到干擾。如何改善其穩定性和指示的專一性，仍然是今后研究的方向。

(3)對于土壤重金屬污染物的生態監測，蚯蚓生物標志物作為監測指標的應用，與有機污染物相似，應用最多的監測指標同樣為個體及種群水平的蚯蚓生物標志物，其研究報道所占比例為相關總文獻量的52%。但對于亞個體水平的蚯蚓生物標志物，免疫活性和金屬硫蛋白是應用較多的監測指標。與有機污染物監測不同的是，在重金屬污染物監測中，金屬硫蛋白是一個更直接、更靈敏的監測指標，由于它能夠直接與金屬結合，對重金屬污染具有很好的專屬性，因此，具有較好的應用前景。

綜上所述，蚯蚓不同水平層次的生物標志物均可以作為監測指標，對土壤污染物進行生態監測。這些不同水平層次的生物標志物作為監測指標，可以用于生態毒性監測，也可以用于毒理學的效應研究，但生態毒性監測與毒理學效應研究的目的不同，毒性測試結果主要回答風險管理問題，效應測試則回答機理問題。雖然，現在也鼓勵通過機理和路徑分析方式進行研究，以減少動物實驗量，但是還需要一段較長的發展時間。而且由于蚯蚓所生活的土壤環境組成復雜，這些指標容易受到環境影響，而且不同污染物對這些指標也常常表現出相似的毒性效應。因此，尋找當地蚯蚓監測當地土壤的生物標志物，仍然是目前蚯蚓生態毒理學研究的重點。