不同材質微塑料對三氯生的吸附及其在斑馬魚體內累積分布的影響

盛誠，王馨穎，易珍，張宴，任洪強

污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京大學環境學院，南京 210046

塑料由于具有較高的耐沖擊性、耐磨性和絕緣性以及加工成本低等優點，在全球得到廣泛應用。預計到2050年，全球塑料生產總量將達到330億t[1]。然而，由于塑料化學性質穩定，在環境中難降解，導致大量塑料垃圾在環境中逐年累積。塑料垃圾在環境中經過物理、化學和生物降解作用，會轉變成粒徑更小、比表面積更大的顆粒和碎片[2]，其中，粒徑<5 mm的塑料碎片、纖維或顆粒稱為微塑料(MPs)[3]。作為一種新型污染物，MPs的生態和健康風險已成為環境領域的研究熱點。環境中的MPs可以分為原生MPs和次生MPs。原生MPs指在個人護理品和研磨劑等產品中添加的小粒徑塑料顆粒(<5 mm)；次生MPs指環境中較大的塑料碎片通過長期的裂解、磨蝕和自然風化等作用形成的粒徑<5 mm的塑料顆粒[4-5]。

MPs按照聚合物類型可以分為：聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚氯乙烯(PVC)、聚苯乙烯(PS)、聚酰胺(PA)和聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)等，其中，PE、PP和PVC既有較高的產量又有較高的環境檢出率[6]。MPs粒徑微小，在環境中遷移時容易被生物誤食。據統計，截至2015年，在海洋塑料污染中暴露過的物種有693個，其中，267個物種中檢測出了塑料碎片[7]。水生生物主要通過鰓和口攝入MPs，MPs在生物體內的累積和分布受其粒徑影響顯著。例如，Lu等[8]將斑馬魚暴露于不同粒徑PS-MPs(5 μm和20 μm)7 d后，發現5 μm PS-MPs可累積于鰓、腸道和肝臟中，而20 μm PS-MPs只在鰓和腸道中檢測到。

生物攝入MPs會導致炎癥反應、氧化損傷、神經毒性、生殖毒性和代謝紊亂等各種生物效應[9]。此外，MPs具有疏水性強和比表面積大等特性，可從周圍環境中吸附多環芳烴和多氯聯苯等有機污染物，并對生物產生復合毒性[10-11]。研究發現，MPs表面攜帶的化學物質濃度可高出周圍環境濃度10萬倍[12]。MPs通過吸附作用可以影響有機污染物的環境歸趨和生物累積。現有研究多關注粒徑和濃度等因素對微塑料環境行為的影響，對于不同材質MPs對有機污染物的吸附和生物累積影響規律尚缺乏系統研究。

三氯生(TCS)，作為藥物和個人護理品(PPCPs)中常見的抗菌劑，廣泛用于牙膏、漱口水、沐浴露、洗手液、兒童玩具和廚房用具中[13]。TCS在PPCPs中的添加量高達產品質量的0.1%～0.3%，由于PPCPs的廣泛使用，環境中TCS濃度越來越高[14]。一方面，TCS隨著PPCPs的排放進入污水處理系統，在廢水和活性污泥中均檢測到了高濃度TCS；另一方面，經污水處理系統處理后，TCS不能被完全清除，隨出水進入受納水體對環境造成污染。調查發現，美國30個州139條河流中有85條檢測到了TCS的存在，TCS最高濃度達到了2.3 μg·L-1[15]。Chalew和Halden[16]研究發現淡水沉積物中TCS濃度高達53 mg·kg-1(以干重計)。中國也有不少關于TCS在環境中檢出的報道。比如，珠江水域中TCS濃度達1.12 μg·L-1[17]；福州內河沉積物中TCS平均濃度達50.1 μg·kg-1(以干重計)[18]。此外，由于熱穩定性高，TCS還被作為添加劑用于塑料和纖維生產中，最終會隨塑料垃圾一起排入環境，而且實際環境中廣泛存在的TCS和MPs也存在很大的復合污染風險。

目前關于不同材質的MPs對TCS的吸附行為和機理尚不明確，MPs對TCS的吸附是否能夠改變TCS在生物體不同組織器官的累積和分布尚不清楚。因此，選用斑馬魚為模式生物，選取PE、PP和PVC這3種材質的MPs作為模式MPs，研究不同材質MPs對TCS的吸附，并通過斑馬魚暴露實驗研究MPs對TCS體內累積和分布的影響規律。研究結果可為深入探索MPs與其他環境污染物共存時的環境健康風險提供理論基礎。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

3種塑料原料粒徑為60～70 μm，購于華創塑料原料商行。通過冷凍/烘干、粉碎和過篩后獲得粒徑為1～15 μm的3種材質的MPs。TCS和13C12-triclosan均購自美國Sigma公司，純度>99.7%，-20 ℃保存。甲醇(99.9%)購自德國Merck公司。硝酸(68%)、二甲基亞砜(99%)、無水硫酸鎂(99%)和無水乙酸鈉(99%)均購自阿拉丁試劑有限公司(中國上海)。氯化鈉(99.5%)和乙酸(99.8%)購自國藥集團化學試劑有限公司。采用掃描電鏡(Qnanta 250 FEG，美國FEI公司)、傅里葉紅外光譜儀(NEXUS870，美國NICOLET公司)和接觸角儀(DSA100，德國Krüss公司)對MPs進行表征；采用拉曼顯微光譜儀(inViaReflex，美國Renishaw公司)對斑馬魚組織中MPs進行定性分析；采用高效液相色譜儀(Agilent 1260 SL，美國Agilen公司)對吸附體系中TCS濃度進行測定；采用三重四級桿液相色譜質譜聯用儀(Triple TOF 5600，美國AB SCIEX公司)對斑馬魚組織中TCS濃度進行測定。

1.2 實驗方法

1.2.1 吸附實驗

吸附動力學實驗中，分別稱取10 mg PE-MPs、PVC-MPs和PP-MPs加入一系列50 mL棕色玻璃管中，并加入50 mL超純水，充分混合均勻后加入一定體積TCS儲備溶液，吸附體系中MPs和TCS的終濃度分別為200 mg·L-1和300 μg·L-1。將棕色玻璃管放置于恒溫振蕩器中，在25 ℃轉速為180 r·min-1的條件下振蕩。分別在20 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h和168 h共15個時間點取50 mL水樣，用0.22 μm濾膜過濾水樣后收集于玻璃瓶中，置于4 ℃冰箱保存。吸附熱力學實驗中，TCS濃度分別設置為50、100、150、200、250、300、350、400、450和500 μg·L-1，吸附實驗進行168 h后取樣，用0.22 μm濾膜過濾水樣后收集于玻璃瓶中，置于4 ℃冰箱保存。水樣處理后，用高效液相色譜儀測定TCS濃度。MPs對TCS的吸附量由初始TCS濃度和濾液中剩余TCS濃度相減計算得出。

1.2.2 累積分布實驗

斑馬魚馴養：選用18周齡野生型斑馬魚，購于中國科學院水生生物研究所，體重為(0.32±0.04) g，體長為(30±3) mm。開展正式實驗之前，所有斑馬魚按照以下條件馴養2周，光照∶黑暗(14 h∶10 h)；養殖水pH為7.2±0.5，溶解氧為(6.6±0.3) mg·L-1，電導率為(0.256±0.005) mS·cm-1，硬度為(185±9) mg·L-1CaCO3，紫外燈消毒，每2天測定1次水質參數以確定馴養條件穩定；每天以體重的1%喂食2次。

按照吸附實驗的配比，將200 μg·L-1MPs和300 μg·L-1TCS進行充分混合并振蕩吸附120 h。累積分布實驗分組如下：空白組(養殖水)，TCS組(300 μg·L-1TCS)，TCS+PE組(200 μg·L-1PE-MPs和300 μg·L-1TCS)，TCS+PP組(200 μg·L-1PP-MPs和300 μg·L-1TCS)以及TCS+PVC組(200 μg·L-1PVC-MPs和300 μg·L-1TCS)。斑馬魚隨機分入以上實驗組，累積6 d后取斑馬魚的肝臟、腸道、腦、性腺和剩余魚體進行測定，每個樣本包含3個平行，每個平行為5條魚。實驗過程中，每天換一次水，每次更換1/2的水，并補充對應體積的TCS和MPs混合溶液確保暴露濃度穩定，暴露期間其他條件與馴養條件完全一致。為避免外源塑料的污染，實驗過程中使用的所有耗材均為玻璃材質并經過超純水洗滌，所有實驗用水均為經過0.22 μm濾膜過濾的超純水。

1.3 MPs和TCS的檢測

MPs的定性分析：將采集的組織樣品凍干后，轉移至10 mL的比色管中，加入1 mL硝酸(質量分數為68%)，置于75 ℃水浴鍋中消解30 min。將消解液用1 μm的聚碳酸酯膜過濾，收集濾膜，用拉曼顯微光譜儀對濾膜上的殘余物進行鑒定。拉曼顯微光譜儀的參數設置如下：激光器選用633 nm，光柵選擇1 800 l·mm-1(vis)，光譜范圍中心為1 150 cm-1，曝光時間為1 s，激光功率為100%。

吸附體系中TCS的測定：將吸附動力學和吸附熱力學實驗收集的樣品，超聲混合均勻后，用經過活化平衡后的Oasis-HLB固相萃取小柱進行萃取(流速為每分鐘75滴)。分別用6 mL超純水淋洗，6 mL甲醇洗脫，經氮氣和甲醇復溶后，采用高效液相色譜儀進行測定。測定條件如下：色譜柱C18，柱溫40 ℃，進樣體積10 μL，流動相為甲醇/水(V(甲醇)∶V(水)=90∶10)，流速為0.2 mL·min-1，檢測波長為280 nm。

組織中TCS的測定：將累積分布實驗中收集的樣品凍干后，稱取干重，加入2 mL超純水，勻漿后，轉入15 mL離心管，并加入4 mL乙腈(含體積分數為0.1%的乙酸)，充分混勻后，加入0.5 g無水乙酸鈉和1.5 g無水硫酸鎂，快速震蕩搖勻，冷卻至室溫后，4 000 r·min-1離心5 min，提取上清液。上清液經固相萃取、氮吹和甲醇復溶后，用三重四級桿液相色譜質譜聯用儀進行測定。液相條件：色譜柱柱溫40 ℃，進樣體積10 μL，流動相為甲醇/水，采用梯度洗脫程序(0～4 min，V(甲醇)∶V(水)=70∶30；4～5 min，V(甲醇)∶V(水)=80∶20；5～5.5 min，V(甲醇)∶V(水)=90∶10；5.5～8 min，V(甲醇)∶V(水)=70∶30)。質譜條件：電噴霧離子源為負離子模式，數據采集方式為多反應監測，離子源溫度為150 ℃，去溶劑溫度為350 ℃，去溶劑氣流量為650 L·h-1，毛細管電壓為2.5 kV，碰撞氣流量為50 L·h-1。TCS定量離子對為母離子286.9，子離子35.0，定性離子對為母離子288.9，子離子為35.0。該檢測方法中，TCS在線性范圍1～300 μg·L-1呈良好線性(r2>0.998)。3個加標水平下，TCS的加標回收率為86.3%～108.2%，相對標準偏差(RSD)均≤10%。

1.4 吸附模型及數據處理

本實驗采用準一級反應動力學模型、準二級反應動力學模型和韋伯-莫里斯顆粒擴散模型對動力學實驗結果進行擬合。公式分別如下：

qt=qe(1-exp(-k1t))

(1)

(2)

qt=kit0.5+ci

(3)

式中：qt是任意時刻t時TCS在MPs表面的吸附量，qe是吸附平衡時TCS在MPs表面的平衡吸附量，k1為準一級反應的反應速率常數，k2為準二級反應的反應速率常數，ki為內擴散模型速率常數，ci為涉及到厚度和邊界層的常數。

本實驗采用常用Henry吸附模型和Freundlich吸附模型對吸附等溫線進行擬合，方程如下：

Henry吸附模型：qe=kdce

(4)

(5)

式中：qe是吸附平衡時TCS在MPs表面的平衡吸附量(μg·g-1)；ce是吸附平衡時對應的TCS濃度(μg·L-1)；kd是Henry吸附模型中的吸附常數；KF和1/nf都是與溫度有關的常數，KF與吸附能力有關。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 MPs的表征

對經過冷凍/烘干、粉碎和篩分后符合粒徑需求的MPs用掃描電子顯微鏡(SEM)和傅里葉變換紅外光譜(FTIR)進行表征，結果如圖1所示，3種MPs粒徑均一，集中分布在3～12 μm(>80%)，將不同材質MPs的紅外光譜圖與標準譜圖對比分析，發現PE-MPs、PP-MPs和PVC-MPs表面除標準峰外沒有其他雜質峰，表明加工處理過程沒有改變MPs化學成分，材料可用于后續試驗。此外，使用接觸角儀測定了PE-MPs、PP-MPs和PVC-MPs的接觸角大小，結果如圖2所示，PE-MPs、PP-MPs和PVC-MPs的接觸角分別為135.1°、142.3°和137.7°

2.2 吸附實驗結果

不同材質MPs對TCS的吸附動力學曲線如圖3所示。由圖3可知，TCS在3種不同材質MPs表面的吸附動力學過程呈現出相似的趨勢。吸附開始時，MPs對TCS的吸附速率快，吸附量增加也較快，隨著反應進行到24 h，吸附量增長緩慢，吸附逐漸飽和并趨于平衡，這種吸附過程與文獻中提到的MPs吸附TCS的過程類似[19]。出現這種結果的原因是吸附前期MPs表面的空余吸附位點多，并且固液兩相之間TCS濃度差大，此時，TCS從水相向MPs表面的擴散速率大。但隨著吸附的進行，MPs表面吸附位點逐漸減少，固液兩相之間TCS濃度差也不斷變小，TCS在MPs表面的吸附逐漸趨于平衡。

采用準一級反應動力學模型和準二級反應動力學模型對吸附動力學結果進行擬合，結果如表1所示。準一級反應動力學擬合得到PP、PE和PVC這3種MPs的r2分別為0.59、0.34和0.77；而準二級反應動力學擬合得到3種MPs的r2均在0.99以上，且準二級反應動力學擬合得出的PP-MPs、PE-MPs和PVC-MPs的平衡吸附量分別為1.22、0.53和0.55 mg·g-1，該擬合結果與實驗所得3種材質的實際吸附量1.18、0.52、0.54 mg·g-1更為貼近。由此可見，準二級反應動力學能更加準確描述本研究中MPs對TCS的吸附過程。此外，實驗結果顯示，PP-MPs對TCS的吸附能力顯著高于PE-MPs和PVC-MPs(P<0.05)。

圖1 不同材質微塑料(MPs)的表征注：(a)掃描電鏡圖(SEM)，(b)粒徑分布圖，(c)傅里葉紅外光譜(FTIR)圖；PVC、PP和PE表示聚氯乙烯、聚丙烯和聚乙烯。Fig. 1 Characteristics of microplastics (MPs) of different polymersNote: (a) scanning electron microscope images; (b) size distribution; (c) Fourier transform infrared spectra; PVC, PP and PE stand for polyvinyl chloride, polypropylene and polyethylene.

圖2 PVC、PP和PE的接觸角Fig. 2 The contact angles of PE, PP and PVC

表1 TSC的吸附動力學模型擬合參數Table 1 Fitting parameters for adsorption kinetics of TCS

為了進一步闡明3種材質MPs對TCS的吸附機理，本研究采用顆粒擴散模型對動力學結果進一步擬合分析，實驗結果如圖4所示。可以看出，TCS在3種MPs上的吸附過程可以分為3個階段：第1階段是TCS在MPs表面的多相吸附過程。在這一階段，TCS通過疏水分配作用、共價鍵力和范德華力等作用吸附在MPs表面，其中疏水分配作用最為關鍵；第2階段是外液膜擴散過程。在此階段，TCS從外液膜緩慢地向微孔內進行擴散；第3階段是吸附平衡階段。在此階段，吸附達到飽和，固液兩相間TCS達到分配平衡[20]。分析得知，TCS在這3種MPs表面的吸附方式主要為表面吸附和外液膜擴散作用。

吸附等溫方程擬合結果如表2所示，Herry吸附模型和Freundlich吸附模型的擬合結果較好。PP-MPs、PE-MPs和PVC-MPs通過Herry吸附模型擬合得到的r2分別為0.918、0.962和0.868，與PVC-MPs相比，PP-MPs和PE-MPs的吸附等溫線更趨近于線性，這可能受微塑料本身性質的影響。根據聚合物的玻璃化轉化溫度，MPs可以分為高彈態和玻璃態。PE-MPs和PP-MPs都屬于高彈態，它們的吸附等溫線一般呈線性，這主要是因為這類聚合物對有機物的吸附不是簡單的表面吸附，而是將吸附的物質分配到聚合物上。PVC-MPs屬于玻璃態，它對有機物的吸附主要是表面吸附，隨著吸附的進行，PVC-MPs表面的吸附位點會越來越少，吸附速率也會隨之降低，從而導致吸附等溫線的線性程度有所降低[21]。通過非線性的Freundlich吸附模型進行擬合，3種材質MPs的吸附等溫線擬合度r2均高于0.75，擬合效果較好，說明TCS在這3種MPs表面的吸附是多層吸附。PP-MPs、PE-MPs和PVC-MPs的Kf值分別為1.014、0.229和0.255，說明吸附能力大小為PP>PE≈PVC。這與動力學實驗結果一致，并且表明MPs的材質對其吸附能力有顯著的影響。為了進一步明確MPs材質對其吸附能力的影響。測定了3種MPs的接觸角大小，結果發現，PP-MPs接觸角最大，接觸角越大，表明材料的疏水性越大，從而對有機物的吸附能力越強[19]。

圖3 三氯生(TCS)在不同材質MPs表面的吸附動力學曲線Fig. 3 The adsorption kinetics of triclosan (TCS) on MPs of different polymers

圖4 TCS在不同材質MPs表面的顆粒擴散模型擬合注：qt表示任意時刻t時TCS在MPs表面的吸附量；t表示吸附時間。Fig. 4 The intraparticle diffusion model of TCS on MPs of different polymersNote: qt stands for the adsorption of TCS on MPs surface at any time; t stands for adsorption time.

表2 TCS的吸附熱力學模型擬合參數Table 2 Fitting paramaters for adsorption isotherms of TCS

2.3 累積分布實驗結果

暴露6 d后，TCS在斑馬魚各組織器官中的累積量如圖5所示。對于單一的TCS暴露，腸道、肝臟、腦、性腺和剩余魚體中均檢出TCS，其累積量分別為191.56、63.92、21.32、25.19和11.59 μg·g-1，其累積規律基本符合腸道>肝臟>腦≈性腺≈剩余魚體。飲食轉移即通過食物鏈或食物網的生物放大作用是水生生物蓄積TCS的重要途徑[22]。進入生物體內的TCS，一部分會在肝臟中經過葡萄糖醛酸化作用或者磺化作用，轉化為水溶性更大的代謝物排出體外；另一部分通過血液循環分散到其他組織器官，最后經過肝腸循環排出體外[23]。由于TCS具有親脂性，因此在脂肪含量高的組織(如肝臟和性腺)中具有高度的生物積累性，而在脂肪含量較低組織中(如肌肉和大腦)，生物積累性則會降低[24]。這與本研究得到的結果存在一定的差異，推測可能是污染物的暴露方式、暴露劑量和暴露時間等因素對TCS在體內的累積分布產生了影響。

圖5 不同實驗組中TCS在各組織的累積量注：*表示復合組與TCS組相比具有顯著性差異，P<0.05；#表示復合組之間對比具有顯著性差異，P<0.05。Fig. 5 The accumulation of TCS in tissues of different experiment groupsNote: *indicates the significant difference between the combined groups and TCS group (P<0.05); # indicates the significant difference between the combined groups (P<0.05).

此外，MPs的存在對TCS在斑馬魚體內的累積分布也產生了影響。與TCS組相比，MPs和TCS的復合暴露組顯著提高了TCS在腸道和肝臟中的累積量，其最大累積量分別為291.12 μg·g-1和161.71 μg·g-1。與TCS組相比，PP+TCS組、PE+TCS組和PVC+TCS組中腸道TCS的累積量分別提高了51.9%、12.7%和38.6%(P<0.05)，肝臟TCS的累積量分別提高了152.9%、70.9%和118.4%(P<0.05)。與其他復合組相比，PP+TCS復合組的所有檢測組織中TCS的累積量均最高(P<0.05)，這可能是由于PP-MPs對TCS的吸附量最大所導致。PP-MPs表面吸附TCS越多，以經口攝入途徑進入生物體內的TCS量則越大，從而提高了TCS在體內的累積量。

為了進一步分析MPs對TCS在生物體內累積分布的影響，分別計算了實驗組中TCS在不同組織器官累積量的百分比，結果如圖6所示。TCS的主要累積器官為腸道和肝臟，其累積量占比均達到了80%以上，且復合組中TCS在腸道和肝臟的累積量占比高于TCS組。TCS組中，TCS在腦、性腺和剩余魚體中的累積量占比分別為6.80%、8.03%和3.70%，而復合組中TCS在腦和性腺中的累積量占比發生了明顯的下降，但剩余魚體中沒有發生明顯變化。此外，MPs的拉曼顯微光譜儀定性分析結果如圖7和圖8所示，斑馬魚的腸道和肝臟均檢測出PP-MPs、PE-MPs和PVC-MPs，而在腦和性腺中則未檢出MPs。先期研究發現微米級MPs經胃腸道攝入后，可穿過腸道上皮細胞進入循環系統，進而到達肝臟[25]。由此可知，MPs的吸附及其在生物體內的分布規律對TCS的生物累積影響顯著。一方面，MPs顯著提高了TCS在腸道和肝臟中的累積量，且MPs吸附能力越強，TCS累積量越高；另一方面，MPs在體內的分布能夠影響TCS在體內的累積分布規律，增加了腸道和肝臟的累積，降低了在腦和性腺的累積。這一結果對MPs和其他有機污染物的復合毒性評價至關重要。

圖6 不同實驗組中TCS在各組織中的累積量占比Fig. 6 The percentage of TCS accumulation in tissues of different experiment groups

圖7 不同材質MPs在腸道中拉曼光譜圖Fig. 7 The Roman spectroscopy of MPs of different polymers in gut

圖8 不同材質MPs在肝臟中拉曼光譜圖Fig. 8 The Roman spectroscopy of MPs of different polymers in liver