有機硒F0代暴露對子代軟骨發育的影響

楚文慶，葛葳，王歡，楊景峰，董武

內蒙古民族大學動物科技學院，內蒙古毒物監控及毒理學重點實驗室，通遼028000

硒元素是人體和動物必需的微量元素，具有獨特的生物學功能，在有機體的生長、發育和預防疾病過程中，發揮著極其重要的作用[1]。硒具有較高的抗氧化作用，其中有機硒生物利用率較無機硒高，且有較低的毒性，從而得到了廣泛的應用[2-3]。有機硒已成功應用在飼料領域，常將有機硒作為添加劑來補充必需微量元素硒，提高牲畜生產能力。隨著硒與人類健康關系的深入研究，含硒藥物的研發也成為國內外學者研究的熱點，研究主要集中于有機硒在抗腫瘤、抗炎和抗高血壓等方面的作用[4-5]。然而，對有機硒的毒性效應和作用機制的研究尚顯不足。

目前，硒對環境的污染和危害已多見報道。已有研究表明，部分湖水中硒濃度達到20 μg·L-1，魚類餌料(無脊椎動物)中的硒的質量濃度達到4～13 mg·kg-1(以濕質量計)[6]。Muscatello和Janz[7]通過對魚群進行分析，發現魚體出現鰓腫脹、貧血、眼球突出以及脊椎、頭、嘴和鰭條等發生畸形現象；同時發現有機硒造成了魚類下一代的畸形和缺陷。美國北卡羅來納州的Belews湖硒污染事件，是因為火力發電廠的燃煤中含有大量的硒元素，排放后造成了周邊河流的污染，從20世紀70年代中期開始，含硒污水便源源不斷排入河流，通過河流進入湖中；相比之下，周邊非硒污染的水體，硒質量濃度約為Belews湖的1/10～1/20，生物體內的硒質量濃度約為Belewas湖內生物體的1/10～1/50，在Belews湖中生存的20種魚中，除了食蚊魚存活外，其他魚類均已滅亡；由此可見，硒污染造成了嚴重的毒性效應[1]。1986年底，電廠停止排放含硒污水，但是魚類種群的恢復速度依舊十分緩慢；經過10年時間，魚類種群雖然有所恢復，但僅有4種，其中，一種是僅存的食蚊魚，一種是消失后又恢復的，另外2種是從其他環境引入的[1]。有關有機硒對水生生物的生態毒性研究有待深入[8]。

青鳉魚(medaka)作為一種重要的水生動物模型，在特定條件下，可以通過控制飼料和水中有毒物質的暴露水平進行毒性實驗。青鳉魚早期發育時，身體透明且發育速度適中，因此，可以有充足的時間，對發育狀況進行詳細的觀察和檢測[9-11]。使用成年青鳉魚考察有機硒飼料對其子代(F1)的影響，有獨特的優勢[12-13]。青鳉魚屬于異性繁殖，其個體卵泡的卵黃發生過程和相關卵母細胞的成熟需要72 h以上[14-15]，暴露的時間至關重要[16]。在此期間，為成熟的卵母細胞提供營養和微量元素的飼料可能與觀察到的結果有關聯[12,16]。因此，本研究以青鳉魚為實驗動物模型，用含有機硒的飼料飼喂F0代親本(父本單獨、母本單獨，以及父本、母本同時)，對比研究不同暴露條件對F1代幼魚早期發育的影響，包括胚胎孵化率、幼魚存活率、畸形類型和畸形率，并通過基因轉錄水平進行驗證。通過上述研究可以獲得有機硒的傳代毒性數據，為有機硒的健康和生態風險評價提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 青鳉魚的培育

青鳉魚由內蒙古民族大學毒物監控及毒理學重點實驗室提供。將成魚飼養在28 ℃的封閉循環水系統中，14 h∶10 h的光照/黑暗交替，每天喂食3次商業干飼料(Pen-tair Aquatic Eco-Systems，Apopka，美國佛羅里達州)和2次鹵蟲。青鳉魚繁育已經超過3 a，孵化率達到85%以上。已經成功用于對各種臟器的毒性研究，包括病理組織學和基因水平的研究等[17]。

1.2 飼料制備

在預實驗中，分別測試了含2、10和50 μg·g-1干重(即1 g普通干飼料中含有2、10和50 μg有機硒)有機硒的飼料對青鳉魚胚胎的影響。其中，含2 μg·g-1有機硒的飼料沒有產生顯著影響，死亡率增高不明顯；10 μg·g-1處理組中出現畸形的胚胎超過20%；50 μg·g-1處理組中死亡胚胎個數增加。因此，筆者選擇5 μg·g-1的有機硒濃度進行進一步測試，并選擇暴露時間為14 d。

制備含有5 μg·g-1干重硒代-L-甲硫氨酸(西格瑪，美國，純度98%)的干燥飼料，具體方法如下。首先，配制含有1 mg·mL-1有機硒的儲備溶液，溶劑為MilliQ水(Millipore，Milli-Q INTEGRAL 5 A10 Water Purification System，美國)。然后，在玻璃培養皿中倒入超過20 g的干燥飼料，并用刮刀徹底混合以確保液體均勻分布。接著，用刮刀將混合物在培養皿的底部展開，以增加表面積促進干燥，再將培養皿置于4 ℃的封閉容器中保存。為促進飼料干燥，每天將飼料分開并攪拌，露出額外的表面區域進行干燥。當飼料顆粒處于或非常接近其原始大小后，再繼續干燥1周。在喂食時將飼料儲存在密閉容器中，以防止水分進入。

1.3 F0代親本暴露方案

暴露方案參照Chernick等[18]的方法進行。從繁育群體中隨機選擇性成熟雄性和雌性青鳉魚(6～9個月)，將雄性和雌性分離并觀察1周，通過確認可存活的胚胎來確定個體的生殖狀態。將選定的魚轉移到實驗缸，并參考自然環境冬季的光照條件保持9 h∶15 h的光照/黑暗時間。在3 L的魚缸中分別放入雄性(5 只·缸-1)和雌性(3 只·缸-1)，在24 ℃條件下孵育。實驗缸內水體使用前曝氣并過夜，配制成千分之一鹽水。把魚隨機分配到4個組：(1)母本暴露，父本未暴露；(2)母本未暴露，父本暴露；(3)母本暴露，父本暴露；(4)母本未暴露，父本未暴露(對照)。每組處理3個重復。

實驗之前，魚在飼養缸內適應3 d，喂食時間表為每天3次，在前2次喂食期間補充無節蟲幼體鹵蟲。在適應期后，根據該時間表將魚喂養14 d，每天加入約1%體重的對照飼料，鹵蟲液體量減少到每次補充3滴，以確保完全攝入干燥的飼料。暴露14 d后，將成年魚輕輕地從罐中取出并沖洗，將罐徹底清洗，并將補充的其他性別的成魚混合到育種組中。在繁殖期間，魚類保持相同的飼喂時間表并控制飼料用量，鹵蟲溶液的量恢復正常以促進產卵。每日虹吸臟污及糞便，以保持水體清潔，并減少缸內廢物中積累的有機硒。觀察成魚的正?；顒?、喂養狀況和應激跡象。

1.4 F1代卵的收集和觀察

成魚暴露實驗結束后，在每次喂食后約20 min時從缸底部虹吸，每天收集含胚卵，連續6 d，或者在每天結束時直接收集卵塊。將胚胎放在濕潤的紙巾上輕輕滾動以分離并清潔，然后轉移到標有收集日期和罐號的培養皿(VWR International，美國)。對未受精和受精的胚胎進行分別計數，并將前者丟棄。受精魚卵置于0.1%(W/V)人工鹽溶液中，每天更換溶液，并在28 ℃的培養箱中保持14 h∶10 h的光照/黑暗循環，在緩慢移動的振蕩器上晃動，直至孵化。

根據Iwamatsu[19]的方法，在立體顯微鏡(Nikon SMZ1500, USA)下每天檢查每個培養皿中的個體發育情況?；畏N類根據文獻[17,20-21]中所用的標準確認，這些類別包括死亡率、孵化時間、顱頜畸形、頜骨大小和形狀的變化，特別是頭部畸形、心囊與卵黃囊水腫情況、眼睛是否對稱、色素是否沉積、脊索畸形、血液流通速度，以及在孵化后個體中鰾是否擴充等各種表型，列出各種表型，計算出表型總和。拍攝受精后3、6和10 d的幼魚，比較對照組與暴露組胚胎的變化(Nikon, DXM1200，NIS-Elements 3.20.01，日本)。

1.5 軟骨染色

幼魚用質量比為10%的甲醛溶液固定24 h后，用質量比為0.1%的Alcian blue 8 GX、體積比為80%的甲醇和體積比為20%的醋酸染色6 h，然后用體積比為75%、50%的酒精以及蒸餾水各浸泡3 h，再用0.05%的胰酶飽和四硼酸鹽、質量比為1%的KOH和體積比為30%的H2O2各處理1 h，最后在體積比為70%的甘油中保存并觀察。

1.6 蘇木-伊紅染色

使用質量比為10%的中性緩沖甲醛溶液固定青鳉魚胚胎于4 ℃過夜。分別用酒精脫水、二甲苯脫水透明后，用石蠟進行包埋處理。包埋后的標本作成5 μm的切片，脫石蠟，然后進行蘇木精-伊紅(HE)染色，用光學顯微鏡對標本進行觀察。

1.7 RNA的提取及基因實時定量PCR(RT-PCR)測定

RNA提取：采用Trizol法制備總RNA，用Trizol (賽默飛世爾科技(上海)有限公司)裂解細胞后，加入氯仿并離心使之分為水相和有機相2層；轉移RNA所在的水相，并用異丙醇沉淀RNA，經體積比為80%的乙醇洗滌后用水(RNase free)溶解；制備的RNA樣品用核酸定量分析儀檢測OD260、OD260/OD280的值，并計算RNA產量。

反轉錄：在體系中加入5×Buffer 4 μL、5 mmoL·L-1dNTP 4 μL、反轉錄抑制劑1 μL、AMV (5 U·μL-1)反轉錄酶2 μL、特異下游引物1 μL、模板5 μL，最后加焦碳酸二乙酯水(DEPC水)至20 μL；在42 ℃下保持60 min后，冰水中冷卻2 min。

Sybr Green Ι RT-PCR方法的建立：在25 μL反應體系中，加入Sybr Green Ι PCR反應混合液12.5 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 1 μL、水9.5 μL；在95 ℃下保持10 min，然后在95 ℃下保持15 s，60 ℃、1 min條件下反應40個循環。

內參基因選擇以及計算：試驗采用18s作為內參基因，采用2-△△CT方法來計算基因表達的相對變化。

1.8 統計分析

對10 dpf (days post fertilizaion)的存活率(或孵化、鰾的膨脹情況)進行個體異常發育的評估。使用非參數單向Kruskal-Wallis分析暴露組的顯著差異。在P≤0.05時，差異顯著。

2 結果(Results)

母本、父本單獨暴露、以及母本、父本同時暴露于有機硒后，所產魚卵的生存率顯著低于對照組，分別是對照組的50%以下(P<0.01)，并且死亡率隨時間推移不斷增加(圖1(a))。在各個有機硒暴露組都出現了不同程度的畸形，如心囊水腫、卵黃囊水腫、血液停滯、視網膜色素沉積減弱、鰾開啟障礙、單眼、顱面畸形、下頜突出和脊索彎曲(圖2～圖4)等。經過統計，父本、母本單獨暴露組，以及母本、父本同時暴露組，與對照組相比，總畸形率分別是對照組的4倍、9倍和9.2倍(P<0.01)，且母本單獨暴露組比父本單獨暴露組差異更明顯(圖1(b))。

圖1 有機硒暴露引起F1代青鳉魚胚胎死亡率、總畸形率和軟骨畸形率增高注：M為父本單獨暴露組，F為母本單獨暴露組，F+M為母本、父本雙方同時暴露組；不同字母表示差異顯著(P<0.05)；有機硒飼喂14 d后，連續收集青鳉魚卵5次，發育至10 d后進行綜合統計分析。Fig. 1 Seleno-L-methionine (Se-Met) causes increased mortality, total deformity and cartilage deformity in medaka embryos of the F1 generationNote: M. Paternal exposure group, F. Maternal exposure group, F+M. Maternal and patental exposure group; the different letters indicate significant difference (P<0.05); male-only, female-only, and male and female of F0 parental medaka were fed with Se-Met for 14 d, and medaka embryos were continuously collected for 5 times; after 10 d of development, comprehensive statistical analysis was performed.

圖2 有機硒引起F1代青鳉魚胚胎畸形注：當給父本單獨(M)、母本單獨(F)或者父本和母本雙方同時(M+F)飼喂有機硒14 d后，讓其交配產卵，連續收集青鳉魚卵5次，發育至3 d和6 d進行鏡下觀察；箭頭在(f)、(g)和(h)圖中分別指示管狀心臟、停止的血流和單眼發育。Fig. 2 Se-Met causes deformity in medaka embryos of the F1 generationNote: Male-only (M), female-only (F), and male and female (F+M) of F0 parental medaka were fed with Se-Met for 14 d, medaka embryos were continuously collected for 5 times, and microscopic observation at 3 d and 6 d; the arrows indicate the tubular heart, stopped blood, and monocular development in (f), (g), and (h), respectively.

圖3 有機硒引起F1代青鳉魚幼魚水腫注：(a) 對照組，(b) 母本、父本雙方同時暴露組；有機硒飼喂14 d后，連續收集青鳉魚卵5次，發育至10 d進行鏡下觀察；(b)中箭頭指示眼球周邊水腫，**指示卵黃囊水腫。Fig. 3 Se-Met causes edema in larva of the F1 generation medakaNote: (a) control group, (b) exposure group (male and female); male and female of F0 parental medaka were fed with Se-Met for 14 d, medaka embryos were continuously collected for 5 times, and microscopic observation at 10 d; arrows in (b) indicate edema around the eyeball, and **indicates edema of the yolk sac.

圖4 有機硒引起F1代青鳉魚幼魚下頜突出注：(a)和(c) 對照組，(b)和(d)母本、父本雙方同時暴露組；有機硒飼喂14 d后，連續收集青鳉魚卵5次，發育至10 d進行鏡下觀察；h表示心臟，紅色箭頭指示畸形的下頜。Fig. 4 Se-Met causes jaw protrusion in larva of the F1 generation medakaNote: (a) and (c) control group, (b) and (d) exposure group (male and female); male and female of F0 parental medaka were fed with Se-Met for 14 d, medaka embryos were continuously collected for 5 times, and microscopic observation at 10 d; h indicates heart, and the red arrow indicates the deformed lower jaw.

在眾多畸形中，下頜骨延伸尤為突出(圖4(b)和(d))，與對照組相比，頭部發育畸形和下頜畸形的發生率在各暴露組具有顯著差異(P<0.05)，父本、母本單獨暴露組，以及母本、父本雙方同時暴露組中畸形率分別為對照組的7倍、9倍和10倍(P<0.01)(圖1(c))，其中，母本單獨暴露組和母本、父本雙方同時暴露組比父本單獨暴露組的畸形發生率更高。經過組織切片結果確認，下頜鰓弓出現顯著的增生(圖4(b)和(d))。經過軟骨染色，也能夠檢測到下頜與顱面軟骨的變形(圖5(f)、(g)和(h))和脊索彎曲(圖5(c)和(d))。

為查明軟骨畸形出現的機制，本研究進行了軟骨關聯基因的檢測，包括SOX9a、SOX9b和Collagen2a1。結果表明，SOX9a的表達在各個組間沒有顯著差異，但各暴露組都有增高的趨勢，而SOX9b基因表達在父本單獨暴露時沒有顯著差異，母本單獨暴露以及母本、父本雙方同時暴露時都出現顯著的增高，分別是對照組的2.6倍和2.57倍(P<0.05)(圖6(a)和(b))。SOX9s下游基因，與軟骨合成直接相關的Collagen2a1，在各個暴露組都出現顯著的表達增高，都達到對照組的4倍以上(P<0.05)(圖6(c))。

圖5 有機硒對F1代青鳉魚幼魚骨骼的影響注：M為父本單獨暴露組，F為母本單獨暴露組，F+M為母本、父本雙方同時暴露組；有機硒飼喂14 d后，連續收集青鳉魚卵5次，發育至10 d進行阿爾新蘭軟骨染色，鏡下觀察；紅色箭頭指示下頜。Fig. 5 Effect of Se-Met on the larva’s bone of the F1 generation medakaNote: M. Paternal exposure group, F. Maternal exposure group, F+M. Maternal and patental exposure group; male-only, female-only, and male and female of F0 parental medaka were fed with Se-Met for 14 d, medaka embryos were continuously collected for 5 times, and Alcian blue cartilage staining was performed when the embryo developed to 10 d; the red arrow indicates the lower jaw.

圖6 有機硒誘導F1代青鳉魚幼魚骨骼關聯基因表達的增加注：M為父本單獨暴露組，F為母本單獨暴露組，F+M為母本、父本雙方同時暴露組；不同字母表示差異顯著(P<0.05)；有機硒飼喂14 d后，連續收集青鳉魚卵5次，發育至10 d后進行RT-PCR。Fig. 6 Se-Met induces an increase in bone-associated gene expression in the larva of the F1 generation medakaNote: M. Paternal exposure group, F. Maternal exposure group, F+M. Maternal and patental exposure group; the different letters indicate significant difference (P<0.05); male-only, female-only, and male and female of F0 parental medaka were fed with Se-Met for 14 d, and medaka embryos were continuously collected for 5 times, and RT-PCR was performed when the embryo developed to 10 d.

3 討論(Discussion)

單獨喂飼母本、父本，或同時飼喂母本、父本有機硒，均會造成F1代生存率的降低，后代畸形的發生率顯著增加，尤其是造成了不同形態的軟骨畸形和發育障礙；這種軟骨發育障礙，與SOX9b和Collagen2a1 mRNA表達的升高有密切關聯。F1代畸形率增高強度依次為母本、父本同時飼喂組，母本單獨飼喂組，父本單獨飼喂組。其中，父本單獨暴露組出現畸形的種類較多。結果表明，不同性別飼喂過量有機硒，其后代的畸形種類和畸形率是不同的。過量飼喂有機硒對母本和父本都有生殖和發育毒性。

小型魚幼魚心囊水腫以及卵黃囊水腫是一種常見的毒性癥狀，出現在很多污染物質的暴露效應中。有機硒的暴露同樣造成心囊、卵黃囊水腫[13,17,22]。筆者在3 d和6 d時，觀察到嚴重的心囊水腫(圖2(c)和(f))，在10 d時觀察到卵黃囊水腫(圖3(b))。同時觀察到血液停滯圖2(g))，這與之前的報道一致[18]。

F1代青鳉幼魚出現高頻率顱面畸形，以及下頜的凸起或者變形。尤其發生在母本、父本青鳉成魚同時飼喂高濃度有機硒的暴露組中，其次是單獨母本或者父本飼喂高濃度有機硒暴露組。類似的顱面畸形和下頜畸形在黑鱒中也觀察到，雖然這種畸形不直接致命，但會影響口腔開合，也可能會影響呼吸[23]。這種特異性顱面畸形表型也提示有機硒飼喂對母本和父本骨骼基因表達產生一定影響[24]。

本研究結果表明，有機硒能夠促進SOX9a、SOX9b和Collagen2a1基因的轉錄表達。骨骼發育中SOX9家族基因是成骨細胞/軟骨細胞的關聯基因，SOX9還可以結合并激活Collagen2基因的轉錄，其表達產物被認為是轉基因小鼠中軟骨細胞分化的早期標志物[25]。青鳉魚有2種SOX9基因(SOX9a和SOX9b)，在軟骨組織中表達[26]。初步可以推測，由于軟骨組織的產生增加，SOX9a和SOX9bmRNA的表達水平升高造成了下頜骨突出、脊索和尾部畸形彎曲。

有機硒經由小腸進入血液，再次進入肝臟和骨骼肌，但沒有觀察到有機硒在卵巢或睪丸中蓄積[27]。這也許是因為暴露時間短尚沒有造成大量的有機硒累積。Thomas和Janz[28]報道了斑馬魚成熟魚卵中的有機硒并沒有集中在卵巢中的現象。有機硒也可直接經由青鳉魚母本滲透到魚卵中[12]。有關魚卵中有機硒的濃度和分布，仍需進一步研究。組織切片分析結果表明，有機硒可能造成精原細胞質量降低和精子凋亡[29]。

綜上所述，與青鳉魚母本或父本單獨暴露組相比，母本、父本同時暴露組會有更多個體出現畸形，并有更多的外觀表型種類。父本單獨飼喂有機硒組出現了非常多的特異表型，這說明，父本暴露也會有很大風險。有機硒的過量攝入對青鳉魚F1代的毒性與軟骨發育通路障礙相關。