乙酸鉛與鄰苯二甲酸雙(2-乙基己基)酯聯合染毒對小鼠學習記憶能力的影響

李聰，代霖，付朝旭，朱雯菲，金銀燕，全昶林，許妍姬

延邊大學醫學院預防醫學教研部，延吉 133002

隨著經濟的高速發展，無論是生活還是生產方面，塑料制品得以大量使用[1-2]。在塑料制品的生產工藝中，為了增加塑料材質的延展性和可塑性，生產過程中往往需要添加鄰苯二甲酸酯類(phthalates acid esters, PAEs)作為增塑劑。隨著人類生活質量和安全意識的提高，增塑劑的毒性效應逐漸受到關注。增塑劑中，鄰苯二甲酸雙(2-乙基己基)酯(diethylhexyl phthalate, DEHP)是目前使用最為廣泛的PAEs有機化合物，被廣泛應用于涂料等建筑材料、食品包裝材料、兒童玩具、辦公用品、化妝品和醫療器材等塑料產品中[3-5]。研究發現，DEHP是一種環境內分泌干擾物(environmental endocrine disruptor, EED)，對機體有生殖毒性、肝臟毒性、免疫毒性以及神經毒性等多種毒性作用，DEHP的毒性研究也越來越受到學者們的關注[6-12]。

鉛是一種用途廣泛的重金屬，在生活和工業生產中處處可見。鉛作為一種重要的成分參與塑料制品的生產過程。聚氯乙烯是一種極性高分子，受熱易分解，產生氯化氫。為解決這個問題，就必須采用熱穩定劑。常用的熱穩定劑有鉛鹽類、金屬皂類、有機錫類和復合穩定劑等。其中，因原料易得價廉、生產工藝簡單，鉛鹽熱穩定劑廣泛應用[13]。隨著鉛的廣泛應用，鉛污染嚴重影響環境和人體健康，鉛中毒主要表現為神經毒性。Pb和DEHP的單一毒性研究已經得到眾多學者的研究證實[14-21]。

日常生活中，人體可以通過多種途徑同時暴露于DEHP和Pb環境中，但現有的研究還僅局限于DEHP和Pb單一污染物對動物的毒性，缺乏二者聯合毒性實驗研究。因此，本實驗將二者聯合染毒，進一步研究DEHP和Pb的聯合作用及機制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗動物

DEHP和Pb均采用體內染毒，選擇80只健康雄性適齡SPF級昆明小鼠(8周齡，體重為(20±2) g)，由延邊大學動物科學實驗中心提供。為減少實驗動物個體差異，保證各組實驗結果的均衡性和準確性，實驗前按照初始體重進行平均分組。在延邊大學醫學院動物飼養房集中飼養，光、暗周期交替，保持清潔，無其他病原體環境，溫度控制在22～25 ℃，相對濕度保持在40%～70%，采用由延邊大學動物科學實驗中心提供的普通飼料喂養，小鼠可以自由飲水、飲食，每日記錄其飲水量和飲食量。在實驗正式開始前，將小鼠放在正常飼養環境3 d。

1.2 實驗試劑與儀器

主要實驗試劑：乙酸鉛(純度99.0%，天津市化學試劑三廠)、鄰苯二甲酸雙(2-乙基己基)酯(純度99.0%，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司)、吐溫80(純度99.0%，天津市科密歐化學試劑有限公司)。

主要實驗儀器：YP600型電子天平(上海精科天平，上海)、SZ-93自動雙重純水蒸餾器(上海生化儀器廠，上海)、全模終端過濾獨立送風凈化籠具(蘇州工業園區唯亭姑秀實驗動物設備廠，江蘇)、Morris水迷宮(上海洛維生物科技有限公司，上海)、小動物避暗穿梭儀與跳臺記錄儀(眾實迪創(北京)科技發展有限責任公司，北京)。

1.3 暴露實驗

1.3.1 試劑配制

將DEHP與吐溫80(Tween-80)按照體積為1∶1助溶，并使用雙蒸水配制成濃度為10、50和200 mg·kg-1的染毒液。將乙酸鉛用雙蒸水溶解配制成1 g·L-1，用于鉛組飲水染毒。

1.3.2 實驗分組與模型建立

選用80只昆明種小鼠，雄性，體重為(20±2) g。實驗前，為減少個體差異而影響實驗分組差異，采取稱量初始體重，按照體重大小平均分為8組，每組各10只，分組見表1。

表1 實驗分組Table 1 Experimental grouping

每天在固定的時間，DEHP處理組按照0.1 mL·(10 g)-1的劑量對小鼠灌胃給藥，CT組和Pb組按照相同比例的劑量給予雙蒸水(DDW)灌胃以作為安慰劑。鉛組用1 g·L-1乙酸鉛通過自由飲水進行染毒，CT組和DEHP組采用雙蒸水自由飲水。聯合染毒處理組用1 g·L-1乙酸鉛通過自由飲水染毒，且按照0.1 mL·(10 g)-1的劑量對小鼠灌胃給藥DEHP。所有各組均自由進食。連續染毒6周，實驗周期共計50 d。實驗期間，每天觀察小鼠的毛色、呼吸和狀態，并記錄各組小鼠體重、進食量以及飲水量。

1.4 動物行為學實驗

1.4.1 小鼠Morris水迷宮實驗

實驗周期的第6周進行小鼠Morris水迷宮訓練，訓練期間照常按時給藥。水迷宮由直徑1.2 m的圓形水池構成，水池中安置有9 cm平臺，由頂部攝像頭進行錄像拍攝，通過視頻分析系統統計分析實驗結果。設定水池分為4個象限，第一、第二和第三象限分別在池壁設置固定投放點，平臺位于第四象限。水池水位位于平臺上1 cm，實驗全程，保持水溫在(25±1) ℃。

標點指引實驗：分別從第一、第二和第三象限的固定位置將小鼠面朝水池壁，頭朝上，投入水中，并同時啟動攝像機錄像功能，時間60 s。記錄小鼠從不同象限游上平臺的時間，所測得的時間稱逃避潛伏期。如果60 s內，小鼠未能成功游上平臺，則需要通過引導棒引導小鼠上臺，讓小鼠停留在平臺10 s，增強學習記憶力。實驗每隔24 h訓練一次，連續訓練6 d，測定小鼠空間學習能力。

平臺尋找實驗：在連續訓練6 d后，間隔24 h，撤去平臺，將小鼠從平臺所在象限的對角象限第二象限固定點位置投放水中，同時啟動攝像機錄像系統記錄數據。記錄小鼠的游泳路線，統計穿臺次數和目標象限停留時間，測定小鼠空間記憶能力[22-23]。

1.4.2 小鼠跳臺實驗

在實驗開始前，把小鼠先放入跳臺測試儀中，使小鼠適應儀器密閉環境3 min。將電壓設定在36 V的交流電上，將小鼠放在跳臺儀中的平臺上，然后開啟儀器，記錄數據。儀器自動記錄小鼠第一次從絕緣平臺跳下的時間，即為相應小鼠的潛伏期數據。連續記錄5 min，小鼠從臺上跳下受到電擊的次數，即為錯誤次數。學習成績階段：記憶獲得階段結束24 h后進行，再次進行小鼠跳臺實驗，記錄跳臺潛伏期和5 min內跳臺錯誤次數。

1.4.3 小鼠避暗實驗

小鼠避暗實驗分為記憶獲得階段和學習成績階段[26]。記憶獲得階段：實驗正式開始記錄前，將小鼠先放入明箱中使其適應儀器明箱環境3 min，暗箱不通電，小鼠可在明暗箱之間自由活動。適應結束后，將小鼠面部背朝洞口放入明箱中，將電壓設定為36 V，啟動儀器進行測定。記錄小鼠第一次從明箱通過洞口到達暗箱受到電擊所用的時間，即為潛伏期。持續記錄5 min，記錄小鼠從明室穿梭到暗室受到電擊的次數，即為錯誤次數。學習成績階段：記憶獲得階段24 h后，再次進行實驗，記錄避暗潛伏期和5 min內避暗錯誤次數。

1.5 生物學指標的測定

1.5.1 實驗動物處理

行為學實驗周期結束后，將各組小鼠禁水禁食12 h，然后稱量各小鼠體重，并采取頸椎脫臼法處死小鼠，解剖并稱量小鼠腦組織(大腦)、心臟、肺、肝臟、脾臟和腎臟，計算其各臟器系數。

1.5.2 腦組織勻漿制備及蛋白含量的測定

通過機械扣腦方法，將小鼠大腦完整取出，置于冰上，去除腦組織表面血液，并準確稱量腦組織重量，按照腦組織重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入生理鹽水，在冰浴條件下，用勻漿器機械勻漿，制備成10%的腦組織(大腦)勻漿液，放入低溫離心機內，2 500 r·min-1離心10 min，收集上清液。

在西方國家，從實質意義上而言，個人本位與社會本位是沒有多大區別的，因為，西方人是在充分實現個人權利的基礎上，全力實現整個社會的公共利益。由此可見，西方的個人本位與社會本位，沒有實質的差異，絕不是中國人所理解的非此即彼的關系，更不具有道德的高低之分。然而，在中國，個人本位與社會本位卻因社會環境的因素，成為水火不容的對立局面。從一定程度來說，還是國人并不理解個人本位與社會本位的實質內涵，以及誤解了西方個人本位與社會本位的關系，錯誤地把社會本位作為一切的重心，完全拋棄了個人本位的價值。其實，推崇社會至上的理論，抹殺個人權利，迎合中國千年的所謂王道精神是極為愚蠢和愚昧的。

按照BCA蛋白濃度測定試劑盒的方法和步驟，準確操作，通過計算標準品的吸光度，制作蛋白標準曲線(R2>0.99)，通過蛋白標準曲線方程，計算各腦組織的蛋白濃度。

1.5.3 腦組織生化指標測定

按照試劑盒說明書，取適量腦組織勻漿液分別測定丙二醛(MDA)含量、過氧化氫酶(CAT)活性、還原型谷胱甘肽(GSH)含量、一氧化氮(NO)含量、總抗氧化能力、單胺氧化酶(MAO)活性和乙酰膽堿酯酶(AChE)活性。通過測定結果，推斷各組小鼠腦組織損傷程度。

1.6 效應相加模型

本實驗采用效應相加模型[27]進行聯合毒性評價分析。該模型假設2種物質之間不相互作用，通過比較化合物混合處理后實測值與理論值之間的統計學差異(P值)，判斷2種化合物的聯合效應。

理論值是指2種物質單獨毒性效應之和，實測值為2種物質聯合作用實際測得的毒性效應。對實測值和理論值進行單因素方差分析，當實測值與理論值之間沒有顯著性差異時(P>0.05)，說明2種物質互不影響，聯合作用表現為相加作用。當實測值與理論值之間具有統計學差異時(P<0.05)，如果實測值顯著低于理論值，則表示二者存在拮抗作用；如果實測值顯著高于理論值，則表示二者為協同作用。

1.7 統計分析

2 結果(Results)

2.1 小鼠體重及臟器系數

2.1.1 各組實驗小鼠觀察結果

各組小鼠經灌胃后，立即觀察到，小鼠活動均減少，DEHP高劑量組小鼠部分出現胃痙攣和嘔吐等現象。CT組和Pb組恢復正常活動的時間相對較短，隨著DEHP濃度增高，小鼠恢復正常活躍度的時間延長。實驗周期結束后，各組小鼠的皮毛光滑。整個實驗周期中，小鼠大小便無異常，眼、鼻和口腔均無分泌物。通過灌胃染毒，小鼠沒有發生運動失調等癥狀，呼吸和飲食飲水均正常，無死亡現象。將小鼠處死后，觀察腹腔各臟器，各臟器均無明顯異常。各組小鼠的攝食量和飲水量無明顯差異(P>0.05)(表2)。

表2 各組實驗觀察結果Table 2 Experimental observation results of each group

2.1.2 各組實驗小鼠體重的變化

分別取實驗周期中每周末小鼠體重，進行相互比較，無明顯差異(P>0.05)(表3)。

表3 各給藥組實驗小鼠體重的變化Table 3 Changes in body weight of experimental mice in each drug-administered group

2.1.3 各組實驗小鼠臟器系數比較

處死小鼠前，稱量小鼠體重，解剖小鼠，取腦、肺、肝、脾、心和腎，稱量各臟器的重量，計算各臟器系數。比較各組小鼠的肺、脾、心和腎的臟器系數，無明顯差異(P>0.05)；各組小鼠腦組織重量，隨著DEHP濃度增加，逐漸降低，與CT組和Pb組相比，DEHP2+Pb組和DEHP3+Pb組均有差異(P<0.05)；隨DEHP濃度升高，肝臟重量在中劑量DEHP處理組和中劑量聯合處理組中降低，與CT組和Pb組相比，DEHP2組和DEHP2+Pb組均有差異(P<0.05)。與單獨染毒組相比，高濃度聯合染毒組毒性效應顯著增強，按效應相加模型對聯合作用方式進行評價，實測值大于理論值，聯合作用表現為協同作用(P<0.05)(表4)。

表4 各組實驗小鼠臟器系數比較Table 4 Comparison of organ coefficients of experimental mice in each group

2.2 行為學實驗結果

2.2.1 小鼠Morris水迷宮實驗結果

各處理組小鼠逃避潛伏期，與空白對照組相比，隨著DEHP濃度增高，逐漸延長(P<0.05)；聯合染毒組分別與DEHP組、Pb組比較，可知聯合染毒后小鼠逃避潛伏期延長明顯(P<0.05)。DEHP和Pb染毒對小鼠空間學習能力有不同程度的損害(表5)。

表5 Morris水迷宮實驗各組小鼠逃避潛伏期Table 5 The mice escape latency of each group in Morris water maze punctuation guide experiment

Morris水迷宮實驗各組小鼠游泳速度無明顯差異(P>0.05)。結果表明，排除各組小鼠的個體差異，染毒處理對各組小鼠體能無明顯影響(表6)。

表6 Morris水迷宮實驗各組小鼠游泳速度比較Table 6 Comparison of swimming speeds of mice in the Morris water maze

Morris水迷宮平臺尋找實驗結果顯示，空白對照組的小鼠在目標象限停留時間最長，小鼠在目標象限的游泳距離占總游泳距離的比例最高，穿臺次數最多；隨著DEHP濃度的增高，上述實驗數據值降低；高濃度聯合染毒實驗結果最低，空間記憶能力障礙明顯(P<0.05)。與單獨染毒組相比，高濃度聯合染毒組毒性效應顯著增強，按效應相加模型對聯合作用方式進行評價，實測值大于理論值，聯合作用表現為協同作用(P<0.05)(表7)。

表7 Morris水迷宮實驗各組小鼠平臺尋找實驗結果Table 7 The results of finding the platform in each group in Morris water maze experiments

由小鼠在平臺尋找實驗中的游泳軌跡來看，空白對照組小鼠記憶能力最強，在水迷宮中目的性很強，游泳軌跡多集中于目標象限，并多次穿越目標平臺；隨著DEHP濃度的增高，小鼠的游泳軌跡逐漸變得無目的和不規則；高濃度聯合染毒組小鼠的游泳軌跡則雜亂無章，多為無目的性探索(圖1)。

圖1 小鼠平臺尋找實驗的游泳軌跡Fig. 1 The swimming trajectories of mice in platform finding task in Morris water maze experiments

2.2.2 小鼠跳臺實驗結果

小鼠跳臺實驗結果顯示，各組小鼠記憶獲得所用時間無明顯差異(P>0.05)；各組小鼠學習成績階段所用時間，隨DEHP濃度和聯合染毒濃度的增高而降低(P<0.05)。高濃度染毒組小鼠的錯誤次數明顯高于空白對照組，聯合染毒組小鼠的學習記憶能力低于單一染毒組(P<0.05)(表8)。

表8 各組小鼠跳臺實驗結果Table 8 The experimental results of mice in each group of step down test

2.2.3 小鼠避暗實驗結果

小鼠避暗實驗結果顯示，各組小鼠記憶獲得潛伏期無明顯差異(P>0.05)；各組小鼠學習成績潛伏期，隨DEHP濃度和聯合染毒濃度的增高而降低，差異明顯(P<0.05)。高濃度染毒組小鼠的錯誤次數明顯高于空白對照組，聯合染毒組小鼠的學習記憶能力低于單一染毒組(P<0.05)。結果表明，聯合染毒對小鼠的學習記憶能力影響更大(表9)。

表9 各組小鼠避暗實驗結果Table 9 The experimental results of mice in each group of darkness test

2.3 腦組織生化指標測定結果

小鼠腦組織各生物學指標測定結果顯示，與CT組和Pb組相比，單獨DEHP處理組中，CAT活性、GSH含量和總抗氧化能力隨著DEHP濃度增加逐漸降低，聯合染毒組與Pb組和對應劑量DEHP染毒組相比明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05，表10)。單獨DEHP處理組與對照組比較，隨著DEHP濃度增加NO含量、MDA含量、MAO活性和AchE活性逐漸增加，聯合染毒組與Pb組和對應劑量DEHP染毒組比較上述4個生化指標明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05，表11)。與單獨染毒組相比，中、高濃度聯合染毒組毒性效應顯著增強，按效應相加模型對聯合作用方式進行評價，實測值大于理論值，聯合作用表現為協同作用(P<0.05)。

表10 小鼠腦組織抗氧化指標測定結果Table 10 Results of antioxidant index in mouse brain tissue

表11 小鼠腦組織NO、MDA、MAO和AChE活力測定結果Table 11 Results of NO, MDA, MAO and AChE activity in mouse brain tissue

3 討論(Discussion)

DEHP是目前使用最為廣泛的增塑劑，鉛鹽作為重要的熱穩定劑被廣泛應用于塑料制品的生產過程中。人體可以通過多種途徑暴露于DEHP和Pb環境中，但是現有的研究還僅局限于DEHP和Pb單一污染物對動物的毒性[28-35]，缺乏二者聯合毒性研究。因此，研究兩者的聯合毒性效應及其發生機制具有重要意義。

本研究發現，DEHP和Pb染毒對小鼠體重、每日攝食量和每日飲水量影響不明顯。各處理組中小鼠的肺臟、脾臟、心臟和腎臟無明顯損傷；隨著染毒濃度增加，腦組織重量逐漸降低，且聯合染毒組更明顯；肝臟重量隨著DEHP濃度升高，在中劑量時降低，在高劑量時有所增加，提示DEHP對肝臟具有毒性作用，并可能在肝臟產生富集作用。行為學實驗結果表明，染毒處理對小鼠的空間學習能力損害明顯，導致小鼠空間記憶能力障礙。聯合染毒組神經毒性作用明顯高于各單一染毒組，用效應相加模型進行評價，表現為協同作用。

為探究其毒性增加是否和氧化損傷相關，分別對MDA、NO、CAT、GSH和總抗氧化能力等氧化損傷指標和MAO、AchE等神經遞質類指標進行測定。隨著DEHP濃度增加，腦組織中MDA含量、NO含量、MAO活性和AchE活性逐漸增加，聯合染毒組MDA含量、NO含量、MAO活性和AchE活性增加明顯，腦組織中CAT活性、GSH含量和總抗氧化能力逐漸降低，聯合染毒組與Pb組和對應劑量DEHP染毒組相比，CAT活性、GSH含量和總抗氧化能力降低明顯。可見，染毒處理導致小鼠腦組織中活性氧增加，清除速率降低，且活性氧作用被放大，抗氧化能力降低，引起細胞代謝及功能障礙，甚至死亡；聯合染毒后細胞損傷明顯，中樞神經系統腦血流量調節障礙，并引發組織細胞產生神經毒性作用，腦組織發生氧化應激反應，從而降低學習記憶能力。MAO和AchE是分解單胺類神經遞質和乙酰膽堿類神經遞質的活性酶，染毒處理可影響MAO和AchE活性，從而導致腦組織中單胺類神經遞質和乙酰膽堿神經遞質減少，導致學習記憶能力障礙。DEHP和Pb聯合染毒的毒性效果增加，用效應相加模型進行評價，表現為協同作用。

相關研究表明，DEHP和甲醛聯合染毒，小鼠學習和記憶能力較單一染毒組受損明顯，其聯合毒性具有一定的增強作用[36]。DEHP能影響外周葡萄糖和胰島素穩態，導致海馬胰島素代謝紊亂，與阿爾茨海默病存在潛在關聯[37]。本實驗結果表明，DEHP可導致學習記憶能力障礙，當與鉛聯合染毒后，腦組織氧化損傷加重，導致學習記憶能力障礙更為明顯。

所有實驗結果，應用效應相加模型進行評價，結果表明，DEHP和Pb聯合毒性并非簡單的相加作用，表現為協同作用。由于兩者在生活中極易接觸，二者的聯合作用還需要從分子毒理學的角度進行深入研究。

目前，聯合作用的評價方法大多數采用2個基本模型，包括效應相加模型[38]與劑量相加模型[39]。本研究采用的效應相加模型評價方法，統計學分析方法簡單，實驗操作簡便易行。方法中將實測值和理論值進行直觀比較，進一步保證了結果的可靠性。但該方法也有不足之處，完全基于受試物某個特定濃度點產生的單獨及聯合效應值的統計學比較，缺少一定的濃度效應關系依據。國內外對于聯合作用的評價方式尚不統一，聯合毒性作用具有特異性，因此，采用不同的評價方式進一步開展研究并從分子學角度進行驗證很有必要的。