BDE-47慢性暴露對小鼠頂葉皮質、海馬和丘腦的影響

莊娟，張佳琪，湯瀟，馬心如，張麗婭，李夢秋

1. 江蘇省高校區域現代農業與環境保護協同創新中心，淮陰師范學院，淮安 223300 2. 江蘇省環洪澤湖生態農業生物技術重點實驗室，淮陰師范學院生命科學學院，淮安 223300 3. 江蘇省藥用植物生物技術重點實驗室，江蘇師范大學，徐州 221116

多溴聯苯醚(PBDEs)，是一種重要的阻燃劑，在化工、建材和電子等領域都有廣泛應用。因PBDEs只添加于產品中，很容易釋放到環境，成為全球性污染[1]。PBDEs具有化學結構穩定和生物蓄積性強的特點，可經食物鏈逐級放大后進入人體[2]。最受關注的是PBDEs對神經系統的危害性。研究表明，PBDEs對兒童具有潛在的神經發育毒性，可影響兒童智力[3]。動物實驗證實了PBDEs對神經系統的危害[4-5]。頂葉皮質、海馬和丘腦組織都與學習記憶有關[6-8]。眾多的研究表明，PBDEs可影響海馬組織[9]，但對頂葉皮質和丘腦的影響尚不清楚。2,2’,4,4’-四溴聯苯醚(BDE-47)是生物體內含量最多、毒性最強的PBDEs之一。筆者之前的研究已證實，BDE-47慢性暴露可導致小鼠學習記憶能力下降[5,10]。本研究主要探究BDE-47慢性暴露對學習記憶相關腦區——頂葉皮質、海馬和丘腦組織的影響及作用機制，為進一步探明BDE-47神經毒機制提供實驗依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗動物

20只7周齡C57BL/6J小鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。飼養溫度(22±1) ℃，濕度50%±10%，光照時間7:30—19:30。自由進水和進食。

1.2 主要試劑和儀器

BDE-47購自Chem. Service公司(美國)，純度>99%；異氟烷購自深圳瑞沃德生命科技有限公司(中國)；尼氏(Nissl)染色液購自上海碧云天生物技術有限公司(中國)；抗NLRP3和Iba1抗體購自Novus公司(美國)；In Situ Cell Death Detection Kit細胞死亡試劑盒購自Roche公司(美國)；Trizol試劑盒購自Invitroge公司(美國)；Takara反轉錄試劑盒和SYBR預混Ex Taq購自寶生物工程(大連)有限公司(中國)。

CM1850冰凍切片機購自Leica公司(德國)；IX71熒光顯微鏡購自Olympus公司(日本)；ViiA 7實時熒光定量PCR儀購自Steponeplus公司(美國)。

1.3 小鼠染毒處理

筆者之前的實驗表明，20 mg·kg-1BDE-47處理8周可導致小鼠海馬組織損傷和學習記憶能力下降[5,10]。本實驗BDE-47暴露劑量和暴露方法按照筆者之前報道的方法進行[10]。BDE-47溶解于玉米油，配制濃度為20 mg·kg-1。小鼠分2組，每組10只，分別用玉米油和BDE-47灌胃，每日處理一次，共處理8周。實驗結束后，小鼠禁食過夜后用異氟烷深度麻醉，取出腦組織，多聚甲醛4 ℃固定2 h。蔗糖梯度脫水后，腦組織進行冰凍切片，切片厚度為12 μm，獲取相應區域的腦片。

1.4 尼氏染色

腦組織切片尼氏染色在室溫下進行，染色5 min，去離子水洗3 min，無水乙醇蘸過后用二甲苯透明5 min，蓋上蓋玻片后用于觀察。

1.5 免疫熒光染色

免疫熒光染色按照筆者之前報道的方法進行[5]。切片用含10%驢血清的封閉液室溫封閉1 h。用抗NLRP3(1∶300)或Iba1(1∶500)抗體，4 ℃孵育過夜。二抗于室溫下孵育1 h后，DAPI染核；熒光顯微觀察，挑取典型區域進行圖像采集。

1.6 實時定量聚合酶鏈反應(PCR)

用Trizol試劑盒提取相應腦組織總RNA，按照Takara反轉錄試劑盒說明，以1 μg RNA為模板用于反轉錄互補DNA。用Takara SYBR預混的Ex Taq進行熒光定量實時PCR反應。IL-1β引物(5’-3’)：AAATACCTGTGGCCTTGGGC，引物(3’-5’)：CTTGGGATCCACACTCTCCAG。IL-6引物(5’-3’)：GTCCTTCCTACCCCAATTTCCAA，引物(3’-5’)：GAATGTCCACAAACTGATATGCTTAGG。GAPDH為內參，檢測目的mRNA含量。

1.7 脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)染色

腦切片先用胰蛋白酶37 ℃處理10 min。然后采用TUNEL反應混合液(Roche公司，美國)于37 ℃作用1 h，DAPI核染；熒光顯微觀察，凋亡細胞在520 nm激發光下發綠色熒光，挑取典型區域進行圖像采集。

1.8 統計方法

實驗數據使用SPSS 11.5統計軟件One-Way ANOVA進行單因素方差分析和Tukey’s顯著性分析，P<0.05為顯著性差異。

2 結果(Results)

2.1 尼氏染色

腦組織經尼氏染色后，顯微鏡下選取與學習記憶相關的頂葉皮質、海馬CA1區和丘腦組織進行觀察并獲取照片，結果如圖1和圖2所示。玉米油對照組小鼠頂葉皮質、海馬和丘腦組織神經元形態飽滿，細胞質較多，體積大，染色均勻，海馬CA1區錐體細胞排列整齊有序；BDE-47暴露小鼠相應區域神經元細胞形態固縮不規則，細胞質少，細胞胞體小，海馬CA1區錐體細胞排列散亂不規則。

2.2 NLRP3免疫熒光染色結果

腦組織經NLRP3特異性免疫熒光染色后，熒光顯微鏡下對頂葉皮質、海馬CA1區和丘腦組織NLRP3的表達情況進行觀察并拍照。結果表明，在小鼠腦組織內，NLRP3在頂葉皮質、海馬CA1區錐體細胞層和丘腦區域都有表達，主要表達在細胞質。與對照組相比，BDE-47處理組小鼠頂葉皮質、海馬CA1區錐體細胞和丘腦區域NLRP3表達均增強(圖3～圖5)。

圖1 小鼠頂葉皮質和海馬顯微結構圖(焦油紫染色)Fig. 1 The representative images of the parietal cortex and hippocampus regions of mice (stained with crystal violet)

圖2 小鼠丘腦組織顯微結構圖(焦油紫染色)Fig. 2 The representative images of the thalamus region of mice (stained with crystal violet)

圖3 小鼠頂葉皮質NLRP3免疫熒光染色結果Fig. 3 The representative images of NLRP3 immunofluorescence staining in the parietal cortex region of mice

圖4 小鼠海馬組織NLRP3免疫熒光染色結果Fig. 4 The representative images of NLRP3 immunofluorescence staining in the hippocampus region of mice

圖5 小鼠丘腦組織NLRP3免疫熒光染色結果Fig. 5 The representative images of NLRP3 immunofluorescence staining in the thalamus region of mice

2.3 Iba1免疫熒光染色結果

Iba1是神經系統中小膠質細胞的標記蛋白。腦組織經Iba1特異性免疫熒光染色后，在熒光顯微鏡下對頂葉皮質、海馬CA1區和丘腦組織中小膠質細胞的形態和分布進行觀察并拍照。結果表明，在對照組小鼠腦組織內，小膠質細胞多呈短棒狀，胞體較小，在頂葉皮質內分布較多，在海馬CA1區次之，在丘腦內分布稀少。慢性BDE-47暴露后，小鼠頂葉皮質、海馬CA1區和丘腦內Iba1信號增強；小膠質細胞形態發生改變，胞體增大(圖6～圖8)。這些結果表明，BDE-47可激活小鼠頂葉皮質、海馬和丘腦組織內的小膠質細胞。

圖6 小鼠頂葉皮質Iba1免疫熒光染色結果Fig. 6 The representative images of Iba1 immunofluorescence staining in the parietal cortex region of mice

圖7 小鼠海馬組織Iba1免疫熒光染色結果Fig. 7 The representative images of Iba1 immunofluorescence staining in the hippocampus region of mice

圖8 小鼠丘腦組織Iba1免疫熒光染色結果Fig. 8 The representative images of Iba1 immunofluorescence staining in the thalamus region of mice

2.4 炎癥因子表達情況

實時定量PCR結果如圖9所示，與對照組相比，BDE-47暴露顯著促進了小鼠頂葉皮質、海馬和丘腦組織炎癥因子IL-1β(頂葉皮質P<0.01；海馬P<0.05，丘腦P<0.05)和IL-6 (頂葉皮質P<0.01；海馬P<0.05，丘腦P<0.05)基因的表達。

圖9 BDE-47對小鼠頂葉皮質、海馬和丘腦組織IL-1β和IL-6基因表達的影響(n=3)注：與對照組相比，*P<0.05、**P<0.01。Fig. 9 BDE-47 enhances the mRNA expression of IL-1β and IL-6 in the parietal cortex, hippocampus and thalamus of mice (n=3)Note: *P<0.05, **P<0.01 versus the control group.

2.5 TUNEL染色結果

腦組織TUNEL染色后，在熒光顯微鏡下對頂葉皮質、海馬CA1區和丘腦組織中TUNEL陽性細胞進行觀察并拍照。結果如圖10所示，對照組小鼠的相應腦區TUNEL陽性細胞很少。經BDE-47暴露后的小鼠頂葉皮質、海馬CA1錐體細胞層和丘腦組織TUNEL陽性細胞增多。

圖10 小鼠頂葉皮質、海馬和丘腦組織TUNEL染色結果注：(a)和(b)為對照組頂葉皮質；(c)和(d)為BDE-47組頂葉皮質；(e)和(f)為對照組海馬組織；(g)和(h)為BDE-47組海馬組織；(i)和(j)為對照組丘腦組織；(k)和(l)為BDE-47組丘腦組織。Fig. 10 Representative images of the fragmented DNA (TUNEL assay) in the parietal cortex, hippocampus and thalamus regions of miceNote: (a) and (b) show parietal cortex of control mice; (c) and (d) show parietal cortex of BDE-47-treated mice; (e) and (f) show hippocampus of control mice; (g) and (h) show hippocampus of BDE-47-treated mice; (i) and (j) show thalamus region of control mice; (k) and (l) show thalamus region of BDE-47-treated mice.

3 討論(Discussion)

神經毒性是PBDEs影響人類健康的重要方面。發育期遭受PBDEs暴露的嬰幼兒表現為智力和行為異常[3]。實驗證據表明，PBDEs暴露導致的學習記憶能力下降與海馬組織受損有關[9]。頂葉皮質在學習及記憶提取過程中具有重要作用[6]。以往的研究表明，BDE-71[11]和BDE-99[12]可影響大腦皮質神經遞質系統，BDE-209暴露可改變小鼠大腦皮質的氧化狀態[13]。但BDE-47暴露是否影響皮質尚不清楚。此外，丘腦也是參與認知功能的重要腦區[8]，但PBDEs是否對丘腦有損傷尚未知曉。筆者之前的實驗結果表明，BDE-47慢性暴露可引起小鼠學習記憶能力下降。本實驗用尼氏染色法檢測學習記憶相關腦區——頂葉皮質、海馬和丘腦組織的組織病理學變化。結果表明，成年小鼠經慢性BDE-47暴露后，學習記憶的關鍵腦區——海馬組織的CA1區錐體細胞排列紊亂，神經元皺縮變小。此外，其頂葉皮質和丘腦組織神經細胞細胞質少，胞體變小，形態固縮不規則，這表明，慢性BDE-47暴露不僅影響海馬組織，還可損傷頂葉皮質和丘腦組織。

慢性神經炎癥是造成神經元功能損傷的重要原因[14]，而NLRP3炎癥體與慢性神經炎癥的發生和發展有關[15]。NLRP3通過與ASC-caspase-1結合形成促炎平臺，產生IL-1β和IL-18炎癥因子。筆者之前的研究結果表明，慢性BDE-47暴露導致的小鼠海馬組織損傷與NLRP3炎癥體激活有關[10]。本實驗結果與前期結果相一致，慢性BDE-47暴露促使小鼠海馬CA1區NLRP3熒光信號增強。同時，炎癥因子IL-1β和IL-6基因表達水平相應上升。此外，筆者發現，BDE-47暴露后，小鼠頂葉皮質和丘腦組織也出現NLRP3熒光信號變強以及IL-1β和IL-6基因表達升高的現象。小膠質細胞是中樞神經系統內固有的免疫效應細胞，介導中樞神經系統損傷的內源性免疫反應[16]。當腦神經系統紊亂或發生炎癥時，小膠質細胞被迅速激活，表現為胞體增大，細胞呈圓形或桿狀。Iba1是小膠質細胞的標記蛋白，小膠質細胞被激活時，Iba1的表達量上調[17]。本實驗結果表明，BDE-47可導致小鼠頂葉皮質、海馬和丘腦組織Iba1免疫熒光信號上調，表明小膠質細胞被激活。這些結果表明，NLRP3炎癥體活化介導的神經炎癥反應可能與BDE-47暴露致小鼠頂葉皮質、海馬及丘腦組織損傷有關。

筆者和其他學者均發現，BDE-47的神經毒作用機制與神經細胞凋亡異常增強有關[10,18]。眾多的研究證據表明，NLRP3炎癥體激活介導的慢性炎癥是促進神經細胞凋亡的重要因素[19]。本實驗研究表明，雖然對照組小鼠頂葉皮質、海馬和丘腦組織也存在TUNEL陽性細胞，但數量很少。BDE-47暴露導致小鼠頂葉皮質、海馬和丘腦組織TUNEL陽性細胞增多，這說明，BDE-47通過促進神經細胞凋亡最終導致頂葉皮質、海馬和丘腦組織損傷。

總之，本研究結果提示，慢性BDE-47暴露可損傷小鼠頂葉皮質、海馬和丘腦組織，其毒性機制可能與NLRP3炎癥體激活介導的慢性神經炎癥及神經細胞凋亡有關。