MgO NPs及其析出的Mg2+對細葉蜈蚣草(Egeria najas)光合作用的影響

鄭博文，徐長山，何惠敏，程亮，郭佳昕，劉曉男

東北師范大學紫外光發射材料與技術教育部重點實驗室，長春130024

納米材料因其特殊的理化性質而在醫學、化學纖維、電子工業和催化等許多領域具有重要的應用價值[1-3]。隨著納米材料進入生態系統的幾率大大增加，其生物安全性也越來越引起人們的重視。金屬氧化物納米粒子作為納米材料中重要的一種，在現代生活中發揮著不可或缺的作用，其生物安全性的研究也同樣倍受關注。氧化鎂納米粒子(MgO NPs)由于其比表面積大、表面活性高和吸附性強等優點，可用作催化劑催化裂解生物質材料，包括草本植物、藻類及有機廢棄物[4]。MgO NPs擁有強抗菌能力，對葡萄球菌和大腸桿菌等表現出完美的抗菌殺菌效果[5]。MgO NPs吸波效果好、抗沖擊能力強，被認為是良好的吸波材料[6]和陶瓷材料[7]。目前，已有關于MgO NPs毒性研究的報道。Ghobadian等[8]報道了高劑量MgO NPs對斑馬魚胚胎孵化有顯著抑制作用，Ali等[9]在研究中發現，MgO NPs對淡水殼菜有毒性效應。

筆者研究MgO NPs對水生植物細葉蜈蚣草(Egerianajas)光合作用的影響。細葉蜈蚣草是屬于水蟹科蜈蚣草屬的沉水植物，具有凈化水質的作用，是水生態系統重要初級生產者。因此，研究MgO NPs對細葉蜈蚣草的影響具有很重要的意義。細葉蜈蚣草的光合作用過程采用葉綠素a熒光檢測法進行測量。葉綠素熒光現象是葉綠素分子吸收光能后，處于激發態的葉綠素分子通過躍遷又恢復到穩定態的過程中產生的發光現象。葉綠素a熒光檢測通過測量光系統Ⅱ(photosystem Ⅱ, PS Ⅱ)發出的熒光的變化來分析植物光合作用的變化[10]。測量葉綠素a熒光的方法有2種：一種是植物經過暗適應處理并用短飽和脈沖光激發后，測量快速熒光動力學曲線；另外一種是經幾分鐘光化光適應處理使葉綠素a熒光恢復穩態，再加飽和脈沖光測熒光產量，進一步分析穩態下的光合作用情況[11]。這2種方法使PS Ⅱ供體側和受體側電子傳遞的研究更加深入。快速葉綠素熒光誘導動力學曲線也稱為OJIP曲線[12-13]，它反映了PS Ⅱ受體側電子從微秒級到秒級的電子傳遞狀況，如PS Ⅱ的電子傳遞、能量捕獲、能量利用率和天線復合體上的激發能依靠質子梯度的熱能耗散等[14]。

為了深入研究MgO NPs及其析出的Mg2+對細葉蜈蚣草光合作用的影響，采用離子選擇性微電極對MgO NPs懸浮液中析出的Mg2+濃度進行了原位實時動態檢測。離子選擇性微電極(ISEM)[15]是一種電化學傳感器，它利用具有離子選擇性的液體離子交換劑(liquid ion exchanger, LIX)將待測離子的活度轉化為膜電位進行測量。與以往對上清液進行電感耦合等離子體原子發射光譜(ICP-AES)測量相比，微電極法避免了上清液中納米粒子殘留及檢測的非實時性帶來的問題，具有操作方便、速度快、靈敏度高和無損傷等優點，能夠在MgO NPs與細葉蜈蚣草相互作用的全過程中，對懸浮液中Mg2+的濃度進行測量。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

MgO NPs和MgCl2(分析純)購自Macklin生化科技有限公司(中國)。MgO NPs粒徑<50 nm，純度>99.9%。細葉蜈蚣草(Egerianajas)購自水族養殖場，用去離子水(UPH-1V-10T，四川優普超純科技有限公司，中國)洗凈并放置在容積10 L的玻璃水缸中，室溫下培養待用。

1.2 MgO NPs懸浮液和Mg2+溶液的配制

用分析天平(XS205DU，梅特勒-托利多公司，瑞士)稱取1、2、3、4、5、6、8和10 mg MgO NPs分別加入到50 mL去離子水中，超聲(KQ-250DB，350 W，昆山市超聲儀器有限公司，中國)分散30 min，得到濃度分別為20、40、60、80、100、120、160和200 mg·L-1的懸濁液。稱取0.375 mg的MgCl2加入到150 mL去離子水中，得到150 mL濃度為2.5 mg·L-1的MgCl2溶液，將溶液按照1∶2∶3∶4∶5的比例分成5份，加離子水制成體積50 mL濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1的Mg2+溶液。

1.3 細葉蜈蚣草培養

隨機選取3根生長狀況一致的細葉蜈蚣草切掉根部與頂部，中間部分均勻分成10段，每段長約2 cm。將共30段細葉蜈蚣草隨機抽取，每2段為1份，共分為15份。將這15份分為2組，一組9份、另一組6份，分別處理。處理一，將一組(9份)細葉蜈蚣草分別暴露在濃度為0、20、40、60、80、100、120、160和200 mg·L-1的MgO NPs懸浮液中(0 mg·L-1為50 mL的去離子水)。處理二，另一組(6份)分別暴露在濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1的Mg2+溶液中。室溫下用植物燈(SY-ZWD-1200W，廣西三熠照明電器有限公司，中國)每天光照8 h，光強約為80 μmol·(m2·s)-1，培養2 d。然后從每一燒杯中2段蜈蚣草上各取3片葉片，每2片一組，共3組，進行葉綠素a熒光檢測。測試前在葉夾內暗適應15 min。

1.4 離子選擇性微電極的性能

使用的離子選擇性微電極是通過將硼硅酸鹽玻璃管(B150-110-10，Sutter Instrument公司，美國)加熱拉制而成，LIX購自北京旭月公司。Mg2+選擇性微電極在標定液濃度10-1～10-5mol·L-1范圍內都有良好的響應，線性回歸系數為0.99984，其檢測下限可達約10-5mol·L-1，檢測精度為1.4%。

1.5 葉綠素a熒光檢測

1.5.1 快速熒光動力學曲線測量

用葉綠素熒光儀(Yaxin-1161G，北京雅欣理儀科技有限公司，中國)在室溫下測量細葉蜈蚣草快速葉綠素熒光誘導動力學曲線(OJIP曲線)。470 nm藍光LED激發，探測波長685 nm，激發光強3 500 μmol·(m2·s)-1。20 μs、2 ms和30 ms的熒光強度分別記為O(Fo)、J(FJ)、I(FI)點，飽和光照下最大熒光強度記為P(Fm)點。

1.5.2 脈沖瞬態熒光動力學曲線測量

用飽和光與光化光脈沖交替激發葉綠素熒光。飽和脈沖寬度為1 s，光強3 500 μmol·(m2·s)-1。光化光脈沖寬度9 s，強度為100 μmol·(m2·s)-1。飽和光照射期間，記錄OJIP曲線，可得到葉片的最大葉綠素熒光(Fm)。光化光照射期間，可測得穩態熒光(FS)。實際最大葉綠素熒光(F’m)在達到穩態熒光后通過照射飽和脈沖測量。

1.6 統計方法

本實驗中，每組葉綠素a熒光檢測均重復3次以上，數據處理采用SSPS 23.0軟件進行方差分析，采用ANOVA方法對實驗數據進行差異顯著性分析(檢驗標準為P<0.05)。*表示P<0.05，**表示P<0.01。實驗結果表示方式為平均值±標準差。

2 結果(Results)

2.1 MgO NPs懸浮液中析出的Mg2+濃度的變化

圖1(a)為培養細葉蜈蚣草時不同濃度MgO NPs懸浮液在48 h內析出Mg2+的情況。在前4 h內不同濃度MgO NPs懸浮液中析出的Mg2+濃度基本不隨時間變化。4 h之后Mg2+濃度逐漸升高，24 h后達到飽和值，范圍在0.7～2.4 mg·L-1之間。當MgO NPs懸浮液濃度達到160 mg·L-1時，析出Mg2+飽和濃度達到2.4 mg·L-1且不再隨MgO NPs濃度的增加而升高。圖1(b)給出了未培養細葉蜈蚣草時，MgO NPs懸浮液在相同時間內析出Mg2+的情況。

圖1 培養(a)與未培養(b)細葉蜈蚣草時不同濃度MgO NPs懸浮液48 h內析出的Mg2+濃度變化Fig. 1 Changes of the concentrations of Mg2+ released in the suspensions of different concentrations of MgO NPs with (a) and without (b) Egeria najas cultivated in them within 48 h

Mg2+濃度隨時間不斷升高，24 h后達到飽和值，范圍在0.9～2.8 mg·L-1之間。比較而言，未培養細葉蜈蚣草的懸浮液中Mg2+濃度較高。

2.2 MgCl2溶液中Mg2+濃度的變化

在初始濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1的MgCl2溶液中培養細葉蜈蚣草時，溶液中Mg2+濃度在48 h內的變化情況如圖2所示，隨著時間的推移，Mg2+濃度都在不斷降低。Mg2+濃度下降的速度也隨時間而改變，在0～4 h內，Mg2+濃度下降較快，4 h后Mg2+濃度的變化逐漸趨緩。

圖2 培養細葉蜈蚣草時，不同濃度MgCl2溶液48 h內的Mg2+濃度的變化Fig. 2 Changes of Mg2+ concentrations in different concentrations of MgCl2 solution within 48 h when cultivating Egeria najas

2.3 MgO NPs處理后細葉蜈蚣草熒光動力學曲線參數的變化

快速葉綠素熒光誘導動力學曲線，又稱OJIP曲線，其中，O、J、I和P點大致在20 μs、2 ms、30 ms和400 ms處，Fo、FJ、FI和FP分別代表O、J、I和P這4點熒光強度。圖3(a)是細葉蜈蚣草經去離子水培養2 d的OJIP曲線，它反映了光合作用中PS Ⅱ電子傳遞狀態。由圖3(b)中可知，細葉蜈蚣草經MgO NPs處理2 d，初始熒光的斜率和J點相對熒光強度發生了改變。熒光強度在濃度為80 mg·L-1之前有隨著濃度的增加而增大的趨勢。而濃度超過80 mg·L-1時，初始熒光的斜率和J點的相對可變熒光強度隨著濃度的增加有減小的趨勢。

圖3 經過去離子水(a)與MgO NPs(b)處理后的細葉蜈蚣草的快速葉綠素a熒光誘導動力學曲線(OJIP)注：在O和P之間將葉綠素a熒光強度做歸一化處理，V=(Ft-Fo)/(Fm-Fo)，(b)中插圖為100～200 μs的OJIP曲線局部放大圖。Fig. 3 The fast chlorophyll a fluorescence induction kinetics curve (OJIP) of Egeria najas after treatment with deionized water (a) and MgO NPs (b)Note: Normalized the fluorescence intensity of chlorophyll a between O and P, V=(Ft-Fo)/(Fm-Fo); the illustration in (b) is a partial enlargement of the OJIP curve of 100～200 μs.

通過JIP測定計算出相應的熒光參數來分析MgO NPs對PS Ⅱ的影響。由圖4(a)可知，MgO NPs濃度為40～100 mg·L-1時，PS Ⅱ反應中心關閉的凈速率(M0)和相對可變熒光強度(VJ)有明顯上升趨勢(P<0.05)。濃度分別為40、60、80和100 mg·L-1時，M0分別上升了37.4%、67.9%、69.5%和47.6%，VJ分別上升25.7%、45.3%、43.2%和32.5%。當MgO NPs濃度為120～200 mg·L-1時，M0和VJ的上升趨勢并不明顯。圖4(b)為細葉蜈蚣草經不同濃度MgO NPs處理后能量利用率的變化。隨著MgO NPs濃度的增加，捕獲激子中用來推動電子傳遞的效率(Ψ0)、最大光化學量子效率(ΦP0)以及電子傳遞的量子產額(ΦE0)呈下降趨勢。當MgO NPs濃度為40～100 mg·L-1時，Ψ0和ΦE0有明顯的下降趨勢(P<0.01)。在濃度為40、60、80和100 mg·L-1時，Ψ0分別下降了20.3%、35.7%、34.0%和25.7%，ΦE0分別下降22.2%、42.3%、44.2%和38.5%。MgO NPs濃度為60～100 mg·L-1時，ΦP0有明顯下降趨勢(P<0.01)。在濃度為60、80和100 mg·L-1時，ΦP0分別下降10.4%、16.1%和17.5%。當MgO NPs為120～200 mg·L-1時，ΦP0下降趨勢不明顯。

圖4 經MgO NPs處理后，細葉蜈蚣草PS Ⅱ關閉的凈速率和J點的葉綠素a相對可變熒光強度的變化(a)與PS Ⅱ能量利用率的變化(b)注：VJ為相對可變熒光強度，M0為PS Ⅱ反應中心關閉的凈速率，Ψ0為電子傳遞的效率，ΦE0為電子傳遞的量子產額，ΦP0為最大光化學量子效率。Fig. 4 The net rate of PS Ⅱ closure and the relative variable fluorescence intensity of chlorophyll a at point J (a) and PS Ⅱ energy utilization (b) in Egeria najas after treatment with MgO NPsNote: VJ is the relative variable fluorescence; M0 is the net rate of the closure of the reaction center of PS Ⅱ; Ψ0 is efficiency of electron transport; ΦE0 is quantum yield of electron transport; ΦP0 is the maximum quantum yield of photochemistry.

圖5(a)為經不同濃度MgO NPs懸浮液處理后，細葉蜈蚣草PS Ⅱ的能量流的變化。從圖中可看出，單位反應中心吸收的光能(ABS/RC)、捕獲的光能(TR0/RC)、用于電子傳遞的能量(ET0/RC)和用于熱耗散的能量(DI0/RC)均有不同程度的變化。MgO NPs濃度為60～100 mg·L-1時，ABS/RC、TR0/RC和DI0/RC隨著MgO NPs濃度增加而明顯升高(P<0.05)，ET0/RC明顯降低(P<0.05)。MgO NPs濃度為80 mg·L-1時變化最為明顯，ABS/RC升高了42.1%，TR0/RC升高17.9%，DI0/RC升高99.5%，ET0/RC降低22.8%。MgO NPs濃度為120～200 mg·L-1時，各參數呈降低趨勢，在200 mg·L-1時，降低趨勢不明顯。圖5(b)為細葉蜈蚣草PS Ⅱ吸收能量耗散過程的變化。隨著MgO NPs濃度增加，PS Ⅱ實際光量子效率(ΦPS Ⅱ)呈下降趨勢，非調節性能量耗散(ΦNO)和調節性能量耗散(ΦNPQ)呈升高趨勢。當MgO NPs濃度為40～200 mg·L-1時，ΦPS Ⅱ下降趨勢明顯(P<0.05)，濃度為120 mg·L-1和160 mg·L-1時，下降趨勢減弱。當MgO NPs濃度為60～120 mg·L-1時，ΦNO升高趨勢非常明顯(P<0.01)。濃度為120 mg·L-1和160 mg·L-1時，升高趨勢減弱。當MgO NPs濃度為40～80 mg·L-1時，ΦNPQ升高趨勢明顯(P<0.05)，而當濃度再升高時，ΦNPQ升高趨勢并不明顯。

圖5 經MgO NPs處理后，細葉蜈蚣草PS Ⅱ能量流的變化(a)和PS Ⅱ吸收能量的耗散過程的變化(b)注：ABS/RC為單位反應中心吸收的光能Fig. 5 Changes in the energy flow of PS Ⅱ (a) and changes in the dissipation process of PS Ⅱ absorbed energy (b) in Egeria najas after treatment with MgO NPsNote: ABS/RC is the absorption flux per reaction center (RC).

2.4 Mg2+處理下細葉蜈蚣草熒光動力學曲線參數的變化

經過不同濃度Mg2+溶液處理后，細葉蜈蚣草各個光合作用參數變化如圖6所示。圖6(a)中M0和VJ呈下降的趨勢，當Mg2+濃度為1 mg·L-1和2.5 mg·L-1時下降明顯(P<0.05)。由圖6(b)可知，捕獲的激子中Ψ0、ΦP0以及ΦE0呈上升趨勢，在Mg2+濃度為1 mg·L-1和2.5 mg·L-1時上升明顯(P<0.05)。由圖6(c)和圖6(d)可知，ABS/RC、TR0/RC、ET0/RC、DI0/RC以及ΦPS Ⅱ、ΦNO、ΦNPQ各個參數均基本不變。

圖6 經不同濃度的Mg2+溶液處理后，細葉蜈蚣草各個光合作用參數變化Fig. 6 Changes in photosynthesis parameters of Egeria najas after treatment with different concentrations of Mg2+ solution

3 討論(Discussion)

根據測得的JIP參數進行分析，發現經不同濃度的MgO NPs處理后，細葉蜈蚣草PS Ⅱ受體側的電子傳遞發生了不同的變化。M0為PS Ⅱ反應中心關閉的凈速率，VJ反映了經光照2 s活性反應中心關閉的程度。由圖4(a)可知，細葉蜈蚣草經過低濃度MgO NPs處理后，PS Ⅱ受體側的電子傳遞和PS Ⅱ反應中心之間的連通性受到抑制。ΦP0表示細葉蜈蚣草經暗適應后PS Ⅱ的最大光化學量子效率，由圖4(b)可知，Ψ0和ΦE0都有所下降，說明MgO NPs抑制了PS Ⅱ對吸收光能的利用。由圖5(a)中可知，經MgO NPs處理后，ABS/RC和DI0/RC都有明顯升高的趨勢。由于TR0/RC沒有ABS/RC和DI0/RC升高明顯，且ET0/RC降低，因此，細葉蜈蚣草葉綠素含量降低，說明MgO NPs抑制了葉綠素合成。這一點與吳明珠等[16]的結果相一致，在他們的報道中，100 mg·L-1的MgO NPs懸液，幾乎完全抑制了葉綠素的合成。由圖5(b)可知，ΦPS Ⅱ隨著MgO NPs濃度增加而降低，說明MgO NPs抑制了PS Ⅱ反應中心吸收的光能用于光合電子傳遞的效率。ΦNPQ和ΦNO有不同程度升高，反映了調節性能量耗散這種保護機制不能抵抗MgO NPs的毒性，PS Ⅱ反應中心受到了損傷。以上結果說明，MgO NPs從多個方面對細葉蜈蚣草光合作用產生了抑制。但當MgO NPs處于高濃度時，大多數熒光參數沒有發生明顯變化。這可能是由于MgO NPs在高濃度時發生團聚，減低了對細葉蜈蚣草的毒性[17]。

由圖6可知，用不同濃度的MgCl2溶液處理的細葉蜈蚣草M0和VJ有下降的趨勢，說明Mg2+促進了PS Ⅱ反應中心之間的連通性。Ψ0、ΦP0和ΦE0呈上升趨勢，說明Mg2+對光能利用率也有促進作用。這種促進作用并不難理解，一方面Mg2+是葉綠素的中心離子，對維持葉綠體的結構和功能起著重要作用，是光合作用中不可或缺的重要元素；另一方面Portis和Heldt[18]曾報道Mg2+能夠從類囊體腔進入基質從而起到優化光合酶活性的作用。

金屬氧化物納米粒子自身與其所釋放的金屬離子各自毒性的大小，一直存在著分歧[19-21]。吳明珠等[16]在研究MgO NPs對斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)的毒性效應及致毒機理時，對培養至對數期的(3 d)的藻液取樣離心后，發現當MgO NPs的濃度為100 mg·L-1時，上清液中的Mg2+濃度為2.14 mg·L-1，與本文在培養細葉蜈蚣草的MgO NPs懸液中測得的數值1.65 mg·L-1大體相當。由于該文中沒有給出未培養藻類的MgO NPs懸液中的Mg2+濃度及培養過程中藻液中Mg2+濃度變化的相關結果，因此，無法判斷斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)對Mg2+的吸收情況。由本文的結果可知，100 mg·L-1的MgO NPs懸液配制完成后，如不加入細葉蜈蚣草，其Mg2+的濃度的飽和值為2.26 mg·L-1。當加入細葉蜈蚣草時，Mg2+的飽和濃度有所減小，為1.65 mg·L-1。MgCl2溶液在培養細葉蜈蚣草的過程中，其Mg2+的濃度也會逐漸下降。Mg2+濃度的下降可能來自于細葉蜈蚣草自身的吸收，也可能來自于Mg2+在細葉蜈蚣草表面的直接吸附或通過吸附于納米顆粒而間接地在細葉蜈蚣草表面聚集[22]。但如果只有單純的表面吸附或聚集，則很難解釋MgCl2溶液中細葉蜈蚣草光合作用的增強，因此，可以認為細葉蜈蚣草對Mg2+有吸收。

由于初始濃度為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1的MgCl2溶液對細葉蜈蚣草的光合作用均起促進作用，因此，盡管MgO NPs懸液中確有Mg2+析出，但其對細葉蜈蚣草光合作用的毒性并非來自Mg2+，而應與MgO NPs自身特殊的物理化學性質有關。

如果把未培養和培養有細葉蜈蚣草的MgO NPs懸液(或MgCl2溶液)中Mg2+濃度的飽和值之差視為細葉蜈蚣草對Mg2+的表觀吸收量，可以發現，當MgO NPs的濃度為80 mg·L-1時，其飽和Mg2+濃度為2.01 mg·L-1，表觀吸收量約為0.36 mg·L-1；而對于初始濃度為2.0 mg·L-1的MgCl2溶液，其表觀吸收量則為0.69 mg·L-1，高出47.8%。這表明，MgO NPs抑制了細葉蜈蚣草對Mg2+的吸收。這種抑制作用可能來自2個方面，一是MgO NPs的存在降低了細葉蜈蚣草自身對Mg2+的吸收能力。二是在高濃度下，納米粒子在細葉蜈蚣草表面沉積形成阻擋層，阻礙了細葉蜈蚣草表對Mg2+的吸收。由于MgO NPs懸液在作用于細葉蜈蚣草之前其游離Mg2+濃度已經達到穩定值，故MgO NPs對Mg2+的吸附應該已經達到飽和，其對表觀吸收量的影響略去不計。Perreault等[20]曾報道CuO NPs對膨脹浮萍(LemnagibbaL.)的毒性主要源于其顆粒釋放的Cu2+。CuO NPs與MgO NPs致毒機理不同的原因可能和Mg2+在葉綠素中處于弱結合點位有關[23]，過量的Cu2+會代替Mg2+點位導致植物缺鎂。

綜上所述，經MgO NPs處理后，細葉蜈蚣草的M0和VJ上升，表明MgO NPs減弱了PS Ⅱ反應中心之間的連通性并抑制了PS Ⅱ受體側的電子傳遞；ABS/RC和TR0/RC升高以及ΦNPQ和ΦNO降低，說明部分PS Ⅱ反應中心失活；DI0/RC的升高以及ET0/RC、ΦPS Ⅱ、Ψ0、ΦE0和ΦP0的降低則表明MgO NPs抑制了PS Ⅱ對吸收光能的利用。而經MgCl2溶液處理后，細葉蜈蚣草的M0和VJ降低、Ψ0、ΦE0和ΦP0升高，表明Mg2+促進反應中心之間的連通性及對吸收光能的利用，即Mg2+促進了細葉蜈蚣草光合作用。盡管MgO NPs懸浮液的確會釋放出Mg2+，但其對細葉蜈蚣草光合作用的毒性來源于MgO NPs本身而非其析出的Mg2+。實驗中還發現，MgO NPs懸浮液中析出的Mg2+濃度并非常數，隨時間推移Mg2+濃度不斷增高并在大約24 h后達到飽和值。加入細葉蜈蚣草后，飽和值的數值有所下降。MgCl2溶液中加入細葉蜈蚣草后，其中的Mg2+濃度也會下降。這一發現彌補了常用的對離心后的上清液進行測量的不足，同時也說明細葉蜈蚣草會吸收MgO NPs懸浮液和MgCl2溶液中的Mg2+。但比較2種情況下的表觀吸收量會發現，MgO NPs抑制了細葉蜈蚣草對Mg2+的吸收能力。