天麻提取物抗帕金森病作用的實驗研究

陳子方 沈凡藝 李江蕊 茍向薇 郭沛鑫

【摘 要】 目的：研究天麻提取物對帕金森病大鼠神經(jīng)行為學障礙的改善作用。方法：采用兩點法于中腦腹側被蓋部和黑質致密部注射6-羥基多巴胺（6-OHDA）復制大鼠帕金森病模型。灌胃給予天麻提取物，每日1次，連續(xù)21 d。以鹽酸去水嗎啡腹腔注射誘導大鼠旋轉，觀察注射5min后30min內大鼠恒定向健側旋轉的轉圈數(shù);以Morris水迷宮實驗觀察大鼠在平臺所在象限的距離百分比（PT%）和停留時間百分比（T%），共同評價天麻提取物對帕金森病大鼠神經(jīng)行為學障礙的改善作用。結果：與模型對照組比較，天麻提取物低劑量組（5 g生藥/kg）、中劑量組（10 g生藥/kg）和高劑量組（20 g生藥/kg）有降低去水嗎啡所誘導的帕金森病大鼠轉圈數(shù)的趨勢（P>0.05）;天麻提取物高劑量組（20 g生藥/kg）在水迷宮的平臺象限距離百分比（PT%）和停留時間百分比（T%）明顯增加（P<0.05）。結論：天麻提取物能明顯改善帕金森病大鼠的神經(jīng)行為學障礙，顯示出明顯的抗帕金森病的作用。

【關鍵詞】 天麻提取物;帕金森病;神經(jīng)行為學障礙;實驗研究

【中圖分類號】R285.5?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2020）21-0020-04

Experimental Study on the Anti-Parkinsons Effect of Gastrodia Extract

CHEN Zifang Shen Fanyi LI Jiangrui GOU Xiangwei GUO Peixin*

Yunnan University of Chinese Medicine，Kunming 650500，China

Abstract：Objective TO study Gastrodia extract on the anti-parkinsons effect.Methods A two-point method was used to inject 6-hydroxydopamine （6-OHDA） into ventral tegmental area （VTA） and substantia nigra pars compacta （SNc） of rats to copy models of parkinsons disease.Gastrodia extract was given by gavage，once per day，continuously for 21 days.The rat rotation was induced by intraperitoneal injection of 0.5mg/kg apomorphine hydrochloride（APO） ，and the numbers of constant rotation to the healthy side were observed within 30 min after 5 min of injection.Morris water maze experiment was used to observe the percentage of distance （PT%） and the percentage of time （T%） that rats stay in the quadrant where the platform is located.To jointly evaluate the improvement effect of Gastrodia extract on neurobehavioral disorders in parkinsons disease rats.Results Compared with the model group，the low-dose group （5 g crude drug / kg），medium-dose group （10 g crude drug / kg），and high-dose group （20 g crude drug / kg） of Gastrodia extract reduced the number of rotation induced by APO（P>0.05）.The high-dose group of Gastrodia extract（20 g crude drug / kg）? increased significantly PT% and T%（P<0.05）.Conclusion Gastrodia extract can significantly improve the neurobehavioral disorders of parkinsons disease rats，and shows obvious anti-parkinsons effects.

Keywords： Gastrodia Extract;Parkinsons Disease;Neurobehavioral Disorders;Experimental Study

帕金森疾病 （Parkinsons Disease，PD） 是一種復雜的神經(jīng)退行性疾病，多發(fā)于中老年人[1]。主要病因為腦內多巴胺能神經(jīng)元的變性壞死致使多巴胺的含量相對不足，目前發(fā)病機制尚不明確[2-3]。雖然在PD早期階段有較好的對癥治療方法，但并不能逆轉神經(jīng)退行性病變的進程[4]。中藥天麻為蘭科天麻屬植物天麻（Gastrodia elata Bl.）的根莖，有息風定驚、平肝潛陽等功效。近年來，關于天麻抗PD的研究報道較多[5-6]，但其有效成份尚不明確。本實驗通過提取天麻成分，觀察天麻提取物對PD大鼠的治療作用，以期闡明中醫(yī)對于天麻善于“息風定驚”的科學內涵，明確其有效部位，為指導天麻治療PD的臨床合理用藥和開發(fā)新藥提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 藥物 天麻提取物，由本實驗室自制（制法：用搖擺式中藥粉碎機將天麻打粉至粗粉，用電子稱稱取天麻粗粉放入圓底燒瓶，分次加入5倍量95%乙醇回流提取3次（2 h∶1 h∶1 h）。合并3次濾液，用旋轉蒸發(fā)儀回收乙醇，將濃縮液加入熱水轉移，按照提取液：乙酸乙酯1∶1.5的比例加入乙酸乙酯萃取四次，合并下層水液，加熱濃縮，然后將濃縮液轉移至恒溫水浴鍋揮至浸膏狀，放入電熱恒溫鼓風干燥箱中繼續(xù)干燥至恒重，即得）。美多芭（批號：SH2061，由上海羅氏制藥有限公司）。

1.2 動物 SD大鼠，雄性，清潔級，體重250～350 g，由四川醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供，動物合格證號：SCXK（川）2013-12。

1.3 試劑 6-羥基多巴胺（6-OHDA，批號：MKBX2602V，Aldrich公司）;阿撲嗎啡（Apomorphine，批號：LKF0204，Wako公司）。其余試劑均為分析純。

1.4 儀器 51500腦立體定位儀（Stoelting 公司）;BW-MIP906型微量注射泵（上海軟隆科技有限公司）;BW-SHD908型高速顱骨鉆（上海軟隆科技有限公司）;cence L 500臺式高速冷凍離心機（Thermo Scientific）;101-OAB烘箱（天津市泰斯特儀器有限公司）;UXF30086V63冰箱（海爾公司）。

2 方法

2.1 帕金森病大鼠模型的復制 將大鼠用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射進行麻醉，俯臥位固定于腦立體定位儀上，門齒低于耳桿2.3 mm，根據(jù)Paxson《The Rat Brain》圖譜，用6-OHDA行腦立體定位注射，制作PD大鼠模型。用0.2%抗壞血酸配制6-OHDA溶液（濃度：5 μg/μL），將上述溶液分別注入右側黑質致密部（SNc，坐標為AP=-4.8 mm，ML=-1.2 mm，DV=-8.2 mm）和中腦腹側被蓋部（VTA，坐標為AP=-4.8 mm，ML=-2.0 mm，DV=-8.0 mm）各4 μL，留針5 min，緩慢退針。傷口處涂抹硫酸慶大霉素，用人工骨蠟封閉顱骨鉆孔，縫合頭皮。造模14 d后，腹腔注射阿撲嗎啡（0.5 mg/kg）誘導大鼠向健側轉圈，選取平均旋轉圈數(shù)≥7 r/min的大鼠作為造模成功大鼠[7]。

2.2 分組及給藥 取PD模型復制成功的大鼠隨機分為模型對照組（給予等體積蒸餾水）、美多芭組（7.8 mg/kg）、天麻提取物低劑量組（5 g生藥/kg）、中劑量組（10 g生藥/kg）、高劑量組（20 g生藥/kg），每組8只。于每天早上8點按上述劑量定時灌胃給藥，灌胃體積為1 mL/100 g，連續(xù)灌胃給藥21 d。

2.3 行為學檢測

2.3.1 對阿樸嗎啡所誘導的PD大鼠神經(jīng)行為學障礙的影響 在給藥期間，每7 d進行1次行為學檢測，腹腔注射阿撲嗎啡（0.5 mg/kg）誘導大鼠轉圈，觀察其行為學變化，記錄注射5 min后30 min內各組大鼠恒定向健側旋轉的轉圈數(shù)，以此評價藥物對大鼠神經(jīng)行為學障礙的改善作用[8]。

2.3.2 水迷宮實驗[9] Morris水迷宮為直徑1.2 m，高0.9 m的圓形水池，水池內壁被漆為黑色，池內水深0.5 m，水溫保持在（22±2） ℃，房間內光照恒定，無光線直射在水池內。池壁上以4個等距離點將水池分為4個象限，在目標象限（設為3象限）內距離池壁35 cm處放有直徑為10 cm高23 cm的圓形黑色站臺，站臺位于水面下2 cm。池壁內側貼有不同形狀的標記物。迷宮上方安置連接顯示系統(tǒng)的攝像機 ，同步記錄大鼠運動軌跡。采用Smart2.0 Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)進行信息處理。

2.3.2.1 記憶訓練期（第1～2 d） 將大鼠面朝池壁放入水中游泳60 s，第1天引導其登上平臺，第2天若在60 s內動物沒有登上平臺則繼續(xù)引導其登上平臺，停留15 s后放入溫暖干燥的籠子結束訓練。

2.3.2.2 記憶增強期（第3～5 d） 每只動物每天早晚各1次實驗，每次分別從除平臺所在方位外的3個方位各放1次，每只動物放入水中的間隔時間為15 s。動物單次游泳時間為60 s，若大鼠在60 s內不能上臺則引導其登上平臺適應15 s后進行下1次實驗。最后將大鼠擦干放入鼠籠。

2.3.2.3 空間探索實驗（第6 d） 撤除平臺，將大鼠從與平臺相對的方位面朝池壁放入水中，讓大鼠自由游泳60 s后將動物擦干放入鼠籠。觀察大鼠在平臺所在象限的距離百分比（PT%）和停留時間百分比（T%），以此來評價藥物對大鼠神經(jīng)行為學障礙的影響（PT%和T%值越大，表明大鼠的認知記憶能力越強）。

2.4 統(tǒng)計學方法 各組數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標準差”（x±s）表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，多組間兩兩比較采用one-way ANOVA，方差齊時采用LSD法，方差不齊時采用Tamhanes T2法。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 對阿樸嗎啡所誘導的PD大鼠神經(jīng)行為學障礙的影響 實驗結果表明，連續(xù)給藥7 d和14 d，天麻提取物各劑量組大鼠轉圈數(shù)與模型對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;連續(xù)給藥21 d，天麻提取物低劑量組（5 g生藥/kg）、中劑量組（10 g生藥/kg）和高劑量組（20 g生藥/kg）有降低阿樸嗎啡所誘導的PD大鼠轉圈數(shù)的趨勢，但與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。上述結果可能與PD大鼠受損側腦區(qū)多巴胺受體的緩慢恢復有關。結果見表1、圖1。

3.2 水迷宮實驗 實驗結果表明，與模型對照組比較，天麻提取物高劑量組（20 g生藥/kg）在水迷宮的平臺象限距離百分比（PT%）和停留時間百分比（T%）明顯增加，組間比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。天麻提取物低劑量組（5 g生藥/kg）和中劑量組（10 g生藥/kg）也能增加大鼠在水迷宮的平臺象限距離百分比（PT%）和停留時間百分比（T%），但與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結果見表2、圖2。

4 討論

PD患者常伴隨著神經(jīng)行為學障礙的發(fā)生，改善神經(jīng)行為學障礙，使患者回歸社會，是藥物治療的重要目的[10]。在本次實驗里，選擇了鹽酸去水嗎啡（APO）所誘導的PD大鼠旋轉實驗和水迷宮實驗來評價天麻提取物抗PD的作用。首先，在APO誘發(fā)PD大鼠旋轉的實驗中，實驗利用立體定位儀，參考大鼠的大腦立體圖譜，將6-OHDA定位注射到大鼠右側黑質致密部和中腦腹側被蓋部，破壞黑質-紋狀體DA系統(tǒng)，使動物毀損側多巴胺能神經(jīng)元缺失、受損，導致多巴胺含量降低，表現(xiàn)為PD樣的癥狀[11-12]。此時，機體在受體調節(jié)機制下，受損側D2受體出現(xiàn)上調，產生超敏感現(xiàn)象，當給予APO激動D2受體后則產生比健側更強的DA活性，故而表現(xiàn)為向健側的旋轉。給藥后，藥物對腦內神經(jīng)元起到保護作用，受損側腦區(qū)受體超敏現(xiàn)象得到改善，但此種改善是一個緩慢的過程，所以實驗僅在給藥21d后觀察到大鼠的轉圈數(shù)有下降的趨勢。在Morris水迷宮實驗中，大鼠在目標象限的距離百分比（PT%）和停留時間百分比（T%）數(shù)值越大，說明其空間學習記憶能力越好[13]。實驗結果表明，天麻提取物高劑量（20 g生藥/kg）能明顯增加PD大鼠在目標象限的距離百分比（PT%）和停留時間百分比（T%）（P<0.05）。

綜上，天麻提取物口服給藥，能增強PD大鼠的學習記憶能力，明顯改善神經(jīng)行為學障礙，但其作用機制尚需進一步研究。

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（收稿日期：2020-06-15 編輯：劉 斌）

基金項目：國家自然科學基金資助（NO.81660671）;云南省科學技術廳-云南中醫(yī)藥大學應用基礎研究聯(lián)合專項資助（NO.2017FF116（-010））;國家重點研發(fā)計劃中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究重點專項資助（NO.2017YFC1703901） 。

作者簡介：陳子方（1996-），女，回族，碩士研究生在讀，研究方向為民族藥。E-mail：2248183463@qq.com

通信作者：郭沛鑫（1976-），男，漢族，博士，副教授，研究方向為中藥及民族藥研究。E-mail：peixin-guo@163.com