Drp1在高糖誘導的大鼠心肌細胞肥大中的作用研究*

吳清蕊，練飛鴻，饒 芳，鄺素娟，楊 慧，吳飛龍，張夢珍, 麥麗萍，林秋雄，單志新，楊 敏，鄧春玉△

(1華南理工大學生物科學與工程學院， 廣東 廣州 510006; 2廣東省心血管病研究所臨床藥理重點實驗室，廣東省人民醫院醫學研究部， 廣東省醫學科學院， 廣東 廣州 510080)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是胰島素分泌絕對或相對不足，以高血糖和高血脂為特征的代謝紊亂綜合征，糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是其常見的心臟并發癥[1]，是DM引起心臟微血管病變和心肌代謝紊亂所致的心肌廣泛局灶性壞死，其病理變化在細胞水平主要表現為心肌細胞肥大，而在亞細胞水平主要表現為線粒體破損、較小線粒體數量增多[2]，具體的發病機制及病理過程目前尚未完全清楚。研究表明，線粒體功能異常是心肌肥厚發生的主要機制[3]，但線粒體分裂(mitochon-drial fission)異常與糖尿病性心肌肥厚的關系少見報道。也有研究顯示，線粒體動力學失衡與許多疾病有密切關系，發動蛋白相關蛋白(dynamin-related protein 1,Drp1)在Ser616位點磷酸化水平增加，Ser637位點磷酸化水平降低可以促進線粒體分裂[4-8]。因此，我們推測Drp1磷酸化水平變化介導的線粒體分裂增加可能參與了糖尿病心肌肥厚的發生，分別在細胞水平和分子水平進行實驗研究，探討線粒體動力學相關蛋白Drp1的磷酸化水平在高糖誘導的心肌細胞肥大模型中的表達變化及其作用機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

出生1～3 d的SD乳大鼠，雌雄不限，SPF級，由南方醫科大學實驗動物中心提供，生產許可證號為SCXK(粵)2016-0041，質量檢測單位為廣東省實驗動物檢測所。

2 主要試劑

兔抗心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)單克隆抗體購自Bioworld Technology；鼠抗Drp1單克隆抗體、兔抗p-Drp1(Ser616)單克隆抗體和兔抗p-Drp1(Ser637)單克隆抗體購自CST；兔抗α-微管蛋白(α-tubulin)單克隆抗體購自Proteintech；脫脂奶粉購自BD；4×SDS 上樣緩沖液、線粒體分裂抑制劑1(mitochondrial division inhibitor 1, Mdivi-1)和4′，6-聯脒-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)購自Sigma；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride, PVDF)膜和放射免疫沉淀實驗(radio immunoprecipitation assay, RIPA)細胞裂解液購自Millipore；麥胚凝集素(wheat germ agglutinin, WGA)購自武漢谷歌生物公司；線粒體膜電位(mitochon-drial membrane potential, MMP)檢測試劑盒(JC-1)和BCA 蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司；5-溴-2′-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2′-deoxyuridine, BrdU)購自Selleck；DMEM培養液和胎牛血清購自Gibco；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)購自武漢博士德公司。

3 主要方法

3.1細胞培養和干預 用酶解分離法將1～3 d的SD乳大鼠心臟消化分離成單個細胞，根據心肌細胞與成纖維細胞的差速貼壁，分離心肌細胞和成纖維細胞，用含雙抗和10%胎牛血清的DMEM(含5.5 mmol/L葡萄糖)培養液將心肌細胞懸液重懸，加入BrdU抑制成纖維細胞增殖，置于包被鼠尾膠原的6孔板中，37℃、5% CO2培養箱培養48 h(其中24 h換液一次)后，換含不同糖濃度的無BrdU的DMEM培養液繼續培養至72 h。將培養的乳大鼠心肌細胞分成6組：對照(control； 5.5 mmol/L葡萄糖)組、高滲透壓(hyperosmosis，HM；33 mmol/L甘露醇)組、DMSO組、高糖(high glucose, HG；33 mmol/L葡萄糖)組、Mdivi-1(10 μmol/L)組和HG+Mdivi-1組(10 μmol/L Mdivi-1預處理3 h后再換成含33 mmol/L葡萄糖的DMEM培養液繼續培養72 h)。

3.2SD乳大鼠原代心肌細胞WGA染色和細胞表面積計算 1～3 d的SD乳大鼠原代心肌細胞分離培養48 h后，高糖組用含33 mmol/L葡萄糖的培養基繼續培養至72 h，PBS漂洗2次，每次5min，用4%多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA)固定細胞15 min后，用PBS漂洗2次，每次5 min，根據產品說明書加入WGA-Alexa Fluor 488，室溫避光孵育10 min后，用PBS漂洗2次，每次5 min， 滴加DAPI染核及封片，激光共聚焦掃描顯微鏡采集圖片，應用Image-Pro Plus 6.0軟件測量心肌細胞的表面積。

3.3JC-1檢測 MMP 將原代心肌細胞分為control組、HM組和HG組，高糖培養72 h后換液，根據產品說明書加入JC-1染料(10 mg/L)避光孵育15 min，PBS漂洗2次后在激光共聚焦顯微鏡下觀察并記錄結果。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變可以檢測到細胞膜電位的下降，用ImageJ 軟件對線粒體膜電位熒光強度進行半定量分析，通過測取圖片中的紅綠熒光的比值，記錄作為線粒體膜電位的原始數據。

3.4Western blot檢測相關蛋白的表達量的變化 提取心肌細胞總蛋白：細胞收板后用PBS漂洗2次，加入含有蛋白酶抑制劑的中性裂解液冰上裂解30 min，用細胞刮促進細胞充分裂解，吸取到EP管靜置、12 000 r/min離心15 min，上清即為細胞總蛋白。BCA 法進行蛋白定量。用裂解液和上樣緩沖液(4 ×)將各樣品配至蛋白量為20 μg，100 ℃變性10 min，進行SDS-PAGE后轉膜，用5%脫脂奶粉將膜浸泡常溫置搖床上封閉1 h，I抗(1 ∶1 000稀釋)4 ℃搖床孵育過夜。第2天用TBST洗膜3次，每次5 min，然后室溫搖床孵育II抗1 h左右(II抗1 ∶5 000稀釋于含5% 脫脂奶粉的TBST)。TBST洗膜3次，每次5 min。用ECL試劑盒顯影蛋白條帶，ImageJ圖像分析軟件測定蛋白條帶灰度值，取目的條帶的灰度值與內參照的灰度值的比值進行統計學分析。

4 統計學處理

用SPSS 22.0統計軟件進行統計學分析，用GraphPad Prism 5將統計結果繪制成柱形圖，計量資料以均數 ± 標準誤(mean±SEM)方式表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 高糖誘導原代心肌細胞肥大

與control組及HM組相比，HG組ANP的蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)，心肌細胞表面積也顯著增加(P<0.01);control組和HM組之間無顯著差異(P>0.05)，見圖1。

Figure 1. High glucose (HG) induced hypertrophy of neonatal rat cardiomyocytes. A: the protein expression of ANP in the neonatal rat cardiomyocytes (n=3); B: immunofluorescence staining (WGA staining) showed the size of the neonatal rat cardiomyocytes (scale bar=50 μm; 50 cells were quantified in each group). Mean±SEM．**P<0.01vsother groups．
圖1 高糖誘導乳大鼠心肌細胞肥大

2 高糖誘導心肌細胞線粒體膜電位降低

與control組及HM組相比，HG組的心肌細胞MMP顯著降低(P<0.01)；control組和HM組之間無顯著差異(P>0.05)，見圖2。

Figure 2. High glucose (HG) induced dissipation of MMP in neonatal rat cardiomyocytes. JC-1 aggregates (red) indicate intact MMP, while JC-1 monomers (green) indicate dissipation of MMP. The scale bar=50 μm. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsother groups.
圖2 高糖誘導線粒體膜電位降低

3 高糖誘導心肌細胞線粒體分裂增加

與control組及HM組相比，HG組p-Drp1 (Ser616)水平顯著升高(P<0.05)，p-Drp1(Ser637)水平顯著減少(P<0.05)，Drp1總蛋白水平無顯著變化(P>0.05)；control組和HM組之間無顯著差異(P>0.05)，見圖3。

Figure 3. High glucose (HG) induced increase in mitochondrial fission. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsother groups．
圖3 高糖誘導線粒體分裂增加

4 線粒體分裂抑制劑Mdivi-1抑制高糖誘導的心肌細胞肥大

與control組相比，HG組ANP和p-Drp1(Ser616)水平顯著升高(P<0.05)，而p-Drp1(Ser637)水平顯著降低(P<0.05);與HG組相比，高糖+Mdivi-1組ANP和p-Drp1(Ser616)水平顯著降低(P<0.05)，而p-Drp1(Ser637)水平顯著升高(P<0.05)，Drp1總蛋白水平無顯著變化(P>0.05)；control組、HM組、DMSO組和Mdivic-1組之間無顯著差異(P>0.05)，見圖4。

Figure 4. Mdivi-1 blocked high glucose (HG)-induced cardiomyocyte hypertrophy. Mean±SEM.n=3．*P<0.05vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group.
圖4 Mdivi-1阻斷高糖誘導的心肌細胞肥大

討 論

本研究結果表明，乳大鼠心肌細胞Drp1蛋白Ser616位點的磷酸化增加而Ser637位點的磷酸化減少導致的線粒體分裂增加，促進了高糖誘導的心肌細胞肥大，抑制Drp1可以顯著緩解高糖誘導的心肌細胞肥大，提示DM導致心肌細胞內線粒體分裂增加可能是心肌肥厚的重要因素。

高血糖是DCM的獨立危險因素[9]，然而，其潛在機制尚未得到充分闡明。以往研究應用高糖培養液培養心肌細胞建立DM代謝損傷細胞模型[10-11]，探索高血糖導致DCM的內在機制[12]，但高糖培養液的含糖濃度及干預時長不定。為了選擇適當的實驗濃度及干預時長，預實驗顯示，相比對照組，葡萄糖濃度為33 mmol/L、刺激72 h時ANP的表達水平穩定增加，細胞的表面積顯著增加。因此本項工作選擇該細胞模型，對高糖誘導心肌細胞肥大的內在機制進行進一步探索。

線粒體功能障礙在調節DM患者糖脂代謝和心功能障礙中擔任著重要角色[13]。據此我們提出假說：高糖通過促進線粒體功能障礙誘導心肌細胞肥大，而線粒體功能可以通過檢測MMP的變化來評價[14-15]。因此，我們分別檢測了不同組心肌細胞的MMP，與前人研究結果[14-15]一致，高糖誘導乳大鼠原代心肌細胞MMP降低，提示高糖作用下心肌細胞出現線粒體功能障礙。

目前認為線粒體動力學異常參與多種心血管疾病的過程[16]，重建線粒體融合-分裂平衡可能為心血管疾病的防治提供新的參考資料[17]。由此，我們設想線粒體分裂異常參與了高糖誘導的心肌細胞肥大的過程。線粒體分裂主要受胞漿Drp1調控，Drp1的Ser616 位點磷酸化水平升高或Ser637 位點磷酸化水平降低都能促進線粒體分裂增加[18]。本研究結果顯示高糖誘導心肌細胞的p-Drp1(s616)水平升高，而p-Drp1(Ser637)水平降低，表明高糖導致心肌細胞線粒體分裂增加，提示線粒體分裂增加可能促進了高糖誘導的心肌細胞肥大，為了進一步證明該結論，我們加入線粒體分裂抑制劑Mdivi-1對原代心肌細胞進行預處理3 h，然后換高糖培養液繼續培養72 h。通過量效實驗顯示，Mdivi-1干預濃度為1 μmol/L、3 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L均可以顯著逆轉高糖誘導的ANP表達水平增加，據此本項工作后續研究Mdivi-1的作用機制采用的干預濃度為10 μmol/L。已有研究表明，Mdivi-1是線粒體分裂的特異性阻斷劑，通過抑制Drp1的GTP酶活性抑制線粒體分裂[19]，而Drp1活性增加主要與Ser616位點磷酸化增加，Ser637位點磷酸化水平降低有關[20]。因此為了驗證線粒體分裂增加促進高糖誘導心肌細胞肥大這一假說，需首先明確本研究中Mdivi-1抑制線粒體分裂的內在機制，研究結果明確了Mdivi-1阻斷高糖誘導的心肌細胞肥大的內在機制是通過降低Drp1在Ser616位點磷酸化水平同時促進Ser637位點的磷酸化，抑制其GTP酶活性，從而降低線粒體分裂，最終緩解高糖誘導的心肌細胞肥大，進一步證明了高糖誘導的心肌細胞肥大與線粒體分裂增加密切相關。

綜上所述，本研究通過原代分離培養乳大鼠心肌細胞，建立高糖誘導的心肌細胞肥大模型，在細胞和蛋白分子水平上，證實了高糖誘導心肌細胞肥大的機制，與Drp1在Ser616位點磷酸化水平升高、Ser637位點磷酸化水平降低導致的線粒體分裂增加有關。