急性創傷性腦損傷患者腦組織miRNA let-7i 水平變化及其臨床意義

童汝有 董黎明

創傷性腦損傷是指暴力作用于頭部造成腦組織器質性損傷，我國每年有超過200 萬人接受創傷性腦損傷治療[1-3]。微小RNA（miRNA）是一類小的（19-28nt）內源性RNA 分子，其通過抑制來調節mRNA轉錄后水平的基因表達。miRNA 與mRNA 中的互補序列結合阻斷mRNA 翻譯[4-5]。組織中的miRNA 高度穩定，對反復凍融循環和酶促降解具有抗性，并且可以在極端pH 條件下存活。由于這些特性，miRNA 最近已成為許多疾病的新型生物標志物[6]。在輕度至嚴重急性創傷性腦損傷患者腦組織中發現特定miRNA改變；嚴重腦損傷時miR-16，miR-92a 和miR-765顯著上調，在輕度創傷性腦損傷的情況下，miR-16和miR-92a 顯著下調[7-9]。研究已經證實急性肝炎、肺炎患者miRNA let-7i 表達水平上調。本研究擬探討急性創傷性腦損傷患者腦組織miRNA let-7i 水平變化及其臨床意義，報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2014 年1 月—2016 年4 月在浙江省金華市人民醫院就診的急性創傷性腦損傷患者105 例為觀察組，其中高血脂23 例、冠心病41例；患者均無6 周內手術史、下肢外傷史、長期臥床史。按照格拉斯哥昏迷評分（glasgow coma scale，GCS）[10]水平分為三組：輕度組（12～14 分為輕度意識障礙）35 例、中度組（9～11 分為中度意識障礙）56 例、重度組（8 分以下為昏迷）14 例；根據創傷性腦損傷發生至手術時間長短分為＜24h 組20 例、≥24h 且≤72h 組45 例和＞72h 組40 例；同期選擇在浙江省金華市人民醫院行腦血管瘤切除術的患者76 例為對照組。觀察組及對照組自愿提供創傷性腦損傷腦組織及管瘤邊緣少量正常腦組織用于本研究，本研究經浙江省金華市人民醫院醫學倫理委員會審核批準，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 急性創傷性腦損傷診斷標準 參照《顱腦創傷臨床救治指南（第3 版）》的診斷標準[11]，并經臨床表現（腦震蕩、顱壓增高、頭痛嘔吐、昏迷、一側瞳孔或雙側瞳孔散大、去大腦強直、呼吸功能紊亂、心血管功能紊亂）、實驗室檢查（血常規、血生化）及常規檢查確診。

2 方 法

2.1 創傷性腦損傷腦組織及正常腦組織miRNA let-7i 水平檢測 使用Trizol LS 試劑（美國Invitrogen 公司，批號14796）和mirVana miRNA 分離試劑盒（加拿大Ambion 公司，批號XA36954）從急性腦損傷腦組織及正常腦組織分離提取總RNA。具體操作步驟為：將2 體積的Trizol LS 與1 體積的氯仿一起加入樣品中。離心后，收集水層并與1.25 體積的無水乙醇混合。然后將其加載到mirVana miRNA分離試劑盒提供的柱上，并根據制造商的方案分離總RNA。總RNA 定量使用Nanodrop 2000 分光光度計（美國Thermo Scientific 公司）進行。用TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit（美國Applied Biosystems 公司，批號15696）進行逆轉錄（RT）。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的管家基因用作內部對照。研究中使用的引物如下所示：miRNA let-7i（3'UTR 序 列）引 物，正 向 5' -TTGCGG -AGGTCACCATAGC-3'；反向5'-TTTCCAACAACGGGCTCA-3'；GAPDH 引物，正向5'-GGGCTGCTTTTAACTCTG-3'；反向5'-TGGCAGGTTTTTCTAGACGG-3'。上述各引物均由上海生工生物工程有限公司設計合成。RT 反應混合物含有大量的莖環狀RT 引物（10×）0.8μL，100mM dNTPs（含dTTP）0.2μL，多份逆轉錄酶（50U/L）1.5μL，10μlRT 緩沖液0.8μL，MgCl2（25mM）0.1μL，RNA 酶抑制劑（20U/L）0.1μL，總RNA 模板（20ng/lL）3μL，無核酸酶水加至終體積7.5μL。在TC-3000G（英國Techne Corp 公司，批號AS3652）上進行PCR，在95℃下保持5min，然后進行40 個循環（95℃15s 和60℃1min）。所有qPCR 反應一式三份進行。使用比較Ct 方法計算倍數變化。

2.2 兩組患者血清IL-4、IL-8、IL-12、IFN-γ、TNFα、hs-CRP 水平測定 兩組患者清晨空腹及肱靜脈抽血，取靜脈血10mL 置于無菌管中，室溫靜置30min，3000rpm 離心，10min，分離血清，MK3-3 酶標儀測定白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、白細胞介素-12（interleukin-12，IL-12）、γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、超敏C-反應蛋白（hypersensitive c-reactive protein，hs-CRP）。IL -4、IL -8、IL -12、IFN -γ、TNF -α、hs -CRP Elisa 試劑盒購于（上海鑫樂生物科技有限公司；批號QA654197、OM169215、MN549651、ZP149218、BC120987、NB016746）。

2.3 隨 訪 對急性創傷性腦損傷患者進行3 年隨訪，隨訪截止日期為2019 年4 月。隨訪方式為電話隨訪，隨訪內容為：生存質量、病情變化、治療效果、進展（死亡）情況等。急性創傷性腦損傷患者組死亡20 例。

2.4 統計學方法 應用SPSS 23.0 進行統計分析。計量資料以均數±標準差（）表示，采用單因素方差分析及t 檢驗比較，多重比較采用LSD-t 檢驗；相關分析采用Pearson 分析，采用多因素Logistic 逐步回歸模型（α 入=0.05、α 出=0.10）探討急性創傷性腦損傷患者死亡發生的危險因素，檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 兩組患者一般資料比較 兩組患者在性別、年齡、吸煙、飲酒分布及BMI、收縮壓、舒張壓水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。

3.2 各組不同程度急性腦損傷患者一般資料比較輕度組、中度組、重度組性別、年齡、吸煙、飲酒分布及BMI、收縮壓、舒張壓水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

3.3 不同腦損傷時間段組別間基礎資料比較 ＜24h組、≥24h 且≤72h 組、＞72h 組性別、年齡、吸煙、飲酒分布及BMI、收縮壓、舒張壓水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

3.4 觀察組與對照組腦組織miRNA let-7i 水平比較 觀察組腦組織miRNA let-7i 水平（5.98±2.18）ng/mL 高于對照組（0.95±0.34）ng/mL，差異有統計學意義（t=8.173，P＜0.01）。

3.5 觀察組與對照組血清IL-4、IL-8、IL-12 水平比較 觀察組血清IL-4、IL-8、IL-12 水平高于對照組（P＜0.01）。見表4。

表1 觀察組與對照組一般資料比較（）

表1 觀察組與對照組一般資料比較（）

注：觀察組為急性創傷性腦損傷患者；對照組為腦血管瘤切除術患者；BMI 為體質指數

表2 各組不同損傷程度急性腦損傷患者一般資料比較（）

表2 各組不同損傷程度急性腦損傷患者一般資料比較（）

注：輕度組為格拉斯哥昏迷評分（GCS）12～14 分；中度組為GCS 9～11 分；重度組為GCS＜8 分；BMI 為體質指數；1mmHg=0.133kPa

3.6 觀察組與對照組血清IFN-γ、TNF-α、hs-CRP水平比較 觀察組血清TNF-α、hs-CRP 均高于對照組（P＜0.05），IFN-γ 低于對照組（P＜0.01）。見表5。

3.7 各組不同損傷程度急性腦損傷患者腦組織miRNA let-7i 水平比較 隨著腦損傷嚴重程度的增加，miRNA let-7i 水平逐漸增加，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表6。

3.8 各組不同腦損傷時間急性腦損傷患者腦組織miRNA let-7i 水平比較 隨著腦損傷時間段的延長，miRNA let-7i 水平逐漸增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表7。

表3 各組不同損傷時間急性創傷性腦損傷患者一般資料比較（）

表3 各組不同損傷時間急性創傷性腦損傷患者一般資料比較（）

注：BMI 為體質指數；1mmHg=0.133kPa

表4 觀察組與對照組血清IL-4、IL-8、IL-12 水平比較（pg/mL，）

表4 觀察組與對照組血清IL-4、IL-8、IL-12 水平比較（pg/mL，）

注：觀察組為急性創傷性腦損傷患者；對照組為腦血管瘤切除術患者；IL-4 為白細胞介素-4；IL-8 為白細胞介素-8；IL-12 為白細胞介素-12

表5 觀察組與對照組血清IFN-γ、TNF-α、hs-CRP 水平比較（）

表5 觀察組與對照組血清IFN-γ、TNF-α、hs-CRP 水平比較（）

注：觀察組為急性創傷性腦損傷患者；對照組為腦血管瘤切除術患者；IFN-γ 為γ-干擾素；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；hs-CRP 為超敏C-反應蛋白

表6 各組不同程度急性腦損傷患者腦組織miRNA let-7i水平比較（）

表6 各組不同程度急性腦損傷患者腦組織miRNA let-7i水平比較（）

注：輕度組為格拉斯哥昏迷評分（GCS）12～24 分；中度組為GCS9～11分；重度組為GCS＜8 分；miRNA let-7i 為微小核糖核酸let-7i；與輕度組比較，aP＜0.05；與中度組比較，bP＜0.05

表7 各組不同腦損傷時間急性腦損傷患者腦組織miRNA let-7i 水平比較（）

表7 各組不同腦損傷時間急性腦損傷患者腦組織miRNA let-7i 水平比較（）

注：miRNA let-7i 為微小核糖核酸let-7i；與＜24h 組比較，aP＜0.05；與≥24h 且≤72h 組比較，bP＜0.05

3.9 存活組、死亡組腦組織miRNA let-7i 水平比較死亡組腦組織miRNA let-7i 水平（7.81±0.35）高于存活組（5.24±1.44），差異有統計學意義（t=12.365，P＜0.01）。

3.10 miRNA let-7i 與各變量相關性分析 miRNA let-7i 與IL-4、IL-8、IL-12、TNF-α、hs-CRP 呈正相關關系（r=0.572、P=0.002；r=0.483、P=0.001；r=0.494、P=0.001；r=0.438、P=0.004；r=0.523、P=0.021），與IFN-γ 呈負相關（r=-0.747、P=0.010）。

3.11 急性創傷性腦損傷患者發生死亡的多元Logistic 回歸分析 對急性創傷性腦損傷患者進行3年隨訪，發生死亡事件20 例。以急性創傷性腦損傷患者是否發生死亡為應變量（是=1，否=0），單因素分析有意義的因素為自變量進行多因素Logistic 逐步回歸分析，結果發現高水平的miRNA let-7i、GCS、TNF-α 均為急性創傷性腦損傷患者發生死亡的危險因素（P＜0.05）。見表8。

表8 急性創傷性腦損傷患者發生死亡的多元Logistic 回歸分析

4 討論

創傷性腦損傷是復雜的級聯事件。在腦損傷后，趨化因子啟動整合素，將淋巴細胞募集到損傷部位，并引導它們進入大腦，隨后這些淋巴細胞與神經細胞一起參與促炎細胞因子介導的內皮激活和趨化因子分泌的刺激。近期研究表明，miR let-7i 是人單核細胞和淋巴細胞的選擇性生物引誘劑，是一種C-Cβ趨化因子[12-13]。急性胰腺炎時miR let-7i 能誘導CD8+T 細胞、血小板、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、成纖維細胞、單核細胞、嗜堿性粒細胞趨化至炎癥和感染的部位[14-15]。體外細胞學試驗已經證明，miR let-7i 通過兩個途徑刺激T 細胞，第一條途徑是通過GPCR 介導的途徑瞬時Ca2+動員導致細胞極化和遷移；第二條途徑是依賴于蛋白酪氨酸激酶（PTK）介導的持續Ca2+激增，導致多種細胞反應，包括T 細胞增殖或凋亡，IL-2、IL-5、IFN-γ 和MIP-1β 的釋放。除誘導趨化性外，miR let-7i 還可作為體外T 細胞的抗原非依賴性激活劑[16]。本研究結果顯示，觀察組腦組織miR let-7i 水平高于對照組；隨著腦損傷嚴重程度的增加，miR let-7i 水平逐漸增加；隨著腦損傷時間段延長，miR let-7i 水平逐漸增加；miR let-7i 與IL-4、IL-8、IL-12、TNF-α、hs-CRP 正相關，與IFN-γ 呈負相關。這與上述討論符合，同時說明，急性創傷性腦損傷患者腦組織miR let-7i 水平升高，其與腦損傷嚴重程度及腦部炎癥反應密切相關。

本研究也發現，高水平miR let-7i、GCS、TNF-α均為急性創傷性腦損傷患者死亡的危險因素。由于miR let-7i 趨化因子的神經毒性功能，針對創傷性腦損傷的靶向特異性療法，結合本研究結果，靶向調節miR let-7i 依賴性途徑的治療可能成為治療大腦和神經退行性疾病等炎癥性腦病的潛在靶點。