絲膠對2型糖尿病大鼠肝臟TRB3的調節作用

劉東慧 付文亮 付秀美 宋成軍 陳志宏

(承德醫學院人體解剖學教研室，河北 承德 067000)

肝細胞Tribbles同源蛋白(TRB)3是哺乳動物Tribbles家族中的一員，在人和鼠的肝臟中高表達〔1〕。TRB3作為胰島素磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路的負性調節因子，主要通過影響Akt來干擾葡萄糖的轉運、肝糖原合成及糖異生等過程，進而引發胰島素信號轉導障礙從而導致胰島素抵抗〔2,3〕。2型糖尿病是一種以胰島素抵抗為主要特征的慢性代謝性疾病，目前臨床的治療仍以藥物為主，各類藥物雖有較好的降糖效果，但毒副作用較大，且不能有效改善胰島素抵抗。因此，尋找一種安全有效的天然降糖藥物十分必要。絲膠(蠶繭水提取物)是一種天然水溶性蛋白，民間亦有蠶繭泡水降血糖的驗方。同時，本課題組在前期進行2型糖尿病的中醫藥防治研究工作時發現絲膠能夠有效降低2型糖尿病大鼠的血糖并對肝臟具有一定的保護作用〔4,5〕，但具體作用機制尚不明確。本研究通過觀察2型糖尿病大鼠肝臟TRB3蛋白和mRNA的表達來探討絲膠降血糖的作用機制，并對一直作為繅絲廢料的絲膠加以有效利用。

1 材料和方法

1.1實驗動物 SPF級雄性SD大鼠36只，體重170～190 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001。將大鼠飼養于承德醫學院實驗動物房(光照時間12 h/d；溫度20～24℃；相對濕度50%～55%)，自由飲水和攝食，正常對照組和造模組大鼠分別給予普通飼料和高脂高糖飼料〔6〕(基礎飼料59%，白砂糖20%，蛋黃3%，豬油18%)喂養。

1.2實驗主要藥物與試劑 絲膠從彩色蠶繭(由承德醫學院桑蠶研究所提供)中提取后干燥成粉末儲存備用，灌胃前用生理鹽水溶解至相應濃度；鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)，臨用前用檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液(pH=4.4)配制成2%的溶液；濃縮型二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒、生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；兔抗TRB3多克隆抗體(美國SANTA CRUZ公司)；二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)；大腸桿菌DH5α感受態細胞、質粒小提試劑盒、pGM-T克隆試劑盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕；反轉錄試劑盒、染料法實時熒光定量試劑盒、PCR引物〔寶生物工程(大連)有限公司〕。

1.3實驗動物分組及處理 將36只大鼠給予普通飼料適應性飼養1 w后隨機分為正常對照組(12只)和造模組(24只)。造模組大鼠給予高脂高糖飼料喂養8 w后，連續2 d腹腔注射鏈脲佐菌素35 mg/(kg·d)，注射72 h后檢測血糖，以空腹血糖≥11.1 mmol/L作為2型糖尿病大鼠成模標準〔7〕。將成模的大鼠隨機分為模型組和絲膠治療組，每組12只，給予絲膠治療組大鼠2.4 g/(kg·d)的絲膠連續灌胃35 d，給予模型組和正常對照組大鼠等體積生理鹽水連續灌胃35 d。灌胃結束，將各組大鼠禁食12 h、稱重、麻醉后取血離心用于檢測血糖，處死后取肝臟一部分放入布安固定液固定，另一部分放入液氮保存用于檢測TRB3的表達。

1.4檢測大鼠血糖水平 將血液離心后分離血清，采用葡萄糖氧化酶法檢測各組大鼠血糖水平。

1.5檢測大鼠肝臟TRB3的表達

1.5.1檢測大鼠肝臟TRB3蛋白的表達 SP免疫組織化學法：肝臟組織固定、包埋后5 μm厚連續切片。將切片脫蠟、37℃ 3%過氧化氫(H2O2)-甲醇孵育30 min、微波抗原修復后，加入一抗(濃度1∶50)4℃過夜，二抗37℃孵育30 min，DAB染色，蘇木素復染肝細胞核，陽性表現為細胞質中出現棕黃色和(或)棕褐色顆粒，以磷酸鹽緩沖溶液(PBS)代替一抗作為陰性對照。定量分析：每只大鼠隨機選取3張非連續肝臟切片，在200倍顯微鏡下觀察，每張切片隨機選取3個視野，采用Image-ProPlus6.0軟件對每個視野中陽性表達產物的積分光密度值測定3次，取平均值作為肝臟TRB3蛋白的表達量。

免疫印跡法：取100 mg液氮中保存的肝臟組織，提取總蛋白并測定濃度。取100 μg總蛋白上樣，12%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，轉膜，封閉后一抗(濃度TRB3 1∶300，β-actin 1∶1 000)、二抗(濃度1∶5 000)室溫搖床分別孵育2.0 h、1.5 h，顯影后應用Quantity One-v 4.6.2軟件對條帶進行灰度分析，以TRB3與β-actin蛋白條帶的灰度比值作為TRB3蛋白的相對表達水平。

1.5.2檢測大鼠肝臟TRB3 mRNA的表達 實時定量PCR法：采用pGM-T質粒載體構建TRB3和內參GAPDH的DNA標準品用以后續定量。取100 mg肝臟組織提取總RNA，并反轉錄成cDNA，再利用實時定量PCR法擴增TRB3和GAPDH，以TRB3拷貝數與相應GAPDH拷貝數的比值作為各組大鼠TRB3 mRNA的相對表達水平。TRB3和GAPDH引物序列見表1。

表1 TRB3及GAPDH基因引物序列及大小

1.6統計分析 利用SPSS24.0統計學軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠血糖水平 與正常對照組相比，模型組血糖明顯升高(t=12.33，P<0.05)；與模型組相比，絲膠治療組血糖明顯降低(t=-8.91，P<0.05)。見表2。

表2 各組血糖及肝臟TRB3蛋白、mRNA的表達

與模型組比較：1)P<0.05

2.2各組大鼠肝臟TRB3的表達 SP免疫組化法結果：各組大鼠肝臟切片均可見TRB3蛋白表達，表現為細胞質中的棕黃色和(或)棕褐色顆粒。見圖1。免疫印跡法結果：在蛋白分子量45 kD、43 kD處可見清晰的TRB3、β-actin條帶。見圖2。實時定量Q-PCR結果：以各組大鼠樣品cDNA和5個濃度梯度的pGM-T-TRB3陽性質粒(1.24×108～1.24×104)作為模板，經過實時定量PCR擴增，得到標準曲線(斜率=-3.160，相關系數r=-0.999，截距=32.751，擴增效率為107.233%)、擴增曲線(典型的S型)、溶解曲線(單峰)。見圖3。TRB3蛋白及mRNA的定量分析結果：模型組肝臟TRB3蛋白及mRNA的表達明顯高于正常對照組(tSP免疫組織化學法=5.62，t免疫印跡法=8.81，t實時定量PCR法=2.67，P<0.05)；絲膠治療組肝臟TRB3蛋白及mRNA的表達明顯低于模型組(tSP免疫組織化學法=-2.32，t免疫印跡法=-4.89，t實時定量PCR法=-3.08，P<0.05)。見表2。

圖1 各組大鼠肝臟TRB3蛋白的表達(SP免疫組織化學法，×200)

1.正常對照組；2.模型組；3.絲膠治療組圖2 各組大鼠肝臟TRB3蛋白的表達(免疫印跡法)

圖3 各組大鼠肝臟TRB3 mRNA的表達(實時定量PCR)

3 討 論

肝臟是胰島素作用的重要靶器官，胰島素與肝細胞膜表面胰島素受體結合后激活胰島素受體底物，活化的胰島素受體底物進一步激活下游的PI3K，PI3K產生第二信使3、4、5-三磷酸酯酰肌醇促使Akt磷酸化后被激活〔8,9〕。Akt活化后主要通過以下三條途徑調節肝細胞內糖類代謝過程：①促進葡萄糖轉運蛋白囊泡向細胞膜轉運，加速將胞外的葡萄糖轉運至胞內〔10,11〕；②促進糖原合成酶激酶-3介導的糖原合成〔12,13〕；③促進轉錄因子-過氧化物酶刺激因子受體協作子α磷酸化而抑制肝細胞糖異生〔14〕。由此可見在肝臟胰島素PI3K/Akt信號轉導通路調節糖類代謝過程中，Akt發揮了十分重要的作用。

TRB3因激酶功能區域缺乏與三磷酸腺苷(ATP)結合的位點及催化核心序列而不具有蛋白激酶的催化活性，被稱為假激酶。研究發現，某些假激酶通過與未磷酸化的Akt結合抑制其活化而導致胰島素PI3K/Akt信號傳導通路障礙〔15〕，其中對TRB3的研究備受關注。Du等〔16〕發現，與正常小鼠相比，db/db糖尿病小鼠肝臟TRB3表達水平增高10～20倍，機制可能是在糖尿病狀態下，胰高血糖素通過環磷酸腺苷途徑激活蛋白激酶，使環磷酸腺苷反應元件結合蛋白磷酸化并與環磷酸腺苷反應元件結合，誘導過氧化物酶刺激因子受體協作子α基因表達。過氧化物酶刺激因子受體協作子α表達后通過激活過氧化物酶體增殖劑激活受體-α，使其與TRB3啟動子上的過氧化物酶體增殖劑激活受體-α調節元件結合進而促進TRB3的表達。TRB3表達升高，作為假激酶與Akt結合后通過阻礙Akt 磷酸化并干擾Akt的轉膜進而影響胰島素PI3K/Akt信號的轉導。

在對TRB3轉基因小鼠肝臟的研究中發現，TRB3可通過抑制Akt磷酸化而降低小鼠的糖耐量，從而使血糖水平升高；而在TRB3基因敲除小鼠體內，肝細胞對胰島素的敏感性明顯提高，Akt磷酸化水平升高，血糖明顯降低〔16〕。由此可見，TRB3可通過Akt影響糖尿病小鼠的血糖水平。本研究發現，模型組大鼠肝臟TRB3蛋白及mRNA表達水平明顯升高，與Du等〔16〕的研究結果一致。而對絲膠治療組大鼠用絲膠蛋白灌胃治療后發現大鼠血糖水平明顯降低，肝臟TRB3蛋白及mRNA的表達顯著下降，提示絲膠可通過下調TRB3的表達，減少對Akt磷酸化及轉膜的抑制作用，使Akt活化增加，從而促進葡萄糖轉運蛋白對葡萄糖的轉運、加速糖原合成酶激酶-3介導糖原合成及增加過氧化物酶刺激因子受體協作子α磷酸化后對肝細胞糖異生的抑制作用，這三方面作用的最終效應將促進肝臟胰島素PI3K/Akt信號轉導通路對糖代謝的調節，從而使得絲膠治療組大鼠血糖顯著降低。

因此，本研究推測絲膠可通過TRB3影響肝臟胰島素PI3K/Akt信號轉導通路中Akt的表達而降低糖尿病大鼠的血糖，這可能是絲膠降血糖的作用機制之一。