非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型的建立及其胰腺、腎臟的組織學病理變化

宋清蓮，譚玉娥，劉京京，袁貝貝，李 敏，賀禮琴，戴光榮

延安大學附屬醫院 消化內科，陜西 延安 716000

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一種與肥胖、2型糖尿病密切相關的代謝性肝損傷疾病[1]。近年來，NAFLD發病率逐年上升，它不僅累積肝臟本身損害，而且還涉及肝外臟器損害[2]，其帶來的經濟負擔逐年上升[3]。美國一項最新大規模前瞻性研究[4]表明，確診為NAFLD的肥胖患者與90%的惡性腫瘤相關，其中與肝癌最為密切,胰腺癌次之。因此早期發現疾病危險因素并干預對患者肝外并發癥的發生至關重要。目前國內外有關非酒精性脂肪性肝炎(NASH)肝外相關臟器病理改變報道較少，本文通過成功構建NASH大鼠模型，觀察胰腺和腎臟病理組織學變化情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 4～5周齡SD雄性大鼠20只，SPF級，體質量80～120 g，購買于西安交通大學醫學部實驗動物中心，許可證編號：SCXK(陜)2018-001。在西安交通大學醫學院實驗動物中心分籠飼養，自由飲食飲水，置于室溫 18～22 ℃、濕度 45%～65%的受控條件下,光照和黑暗各 12 h 模擬晝夜交替的清潔動物房內。 本研究方案經由西安交通大學動物實驗倫理委員會審批(批號：XJTULAC2019.993)，符合實驗室動物管理與使用準則。

1.2 動物分組及建模 所有SD大鼠適應性飼養1周后，將20只SD大鼠中的6只首先按完全隨機配對分配到觀察組(B組)，然后將剩下的14只按體質量配對成7個區組，最后將每個區組中的1只大鼠按隨機數字表分配到實驗組(C組)，其余7只為對照組(A組)。B組和C組給予高脂飲食，A組給予普通飲食。B組于實驗第4、8、12周各處死2只，提取肝組織用4%中性甲醛溶液固定、常規脫水、石蠟包埋、切片并染色，顯微鏡下觀察肝臟病理切片是否達到NASH，第12周末NASH建模成功(提示C組建模成功)。

1.3 飼料與配方 高脂飲食配方：81.8%普通飼料+2.5%膽固醇+0.5%膽酸鈉+10%豬油+5%蛋黃+0.2%丙基硫氧嘧啶；普通飼料和高脂飼料均購買于上海將來實業股份有限公司生產，批號：JL20180925312E。將普通飼料和高脂飼料混合均勻后壓制成條，59 ℃烘干。

1.4 主要材料與試劑 鼠抗大鼠Desmin抗體(Servicebio)、大鼠ALT Elisa試劑盒、AST Elisa試劑盒、GGT Elisa試劑盒、甘油三酯(TG)Elisa試劑盒、總膽固醇(TC)Elisa試劑盒、低密度脂蛋白(LDL)Elisa試劑盒(上海將來實業股份有限公司)，葡萄糖(GLU)Elisa試劑盒(上海將來實業股份有限公司)，胰島素(INS)Elisa試劑盒(上海將來實業股份有限公司)，成像系統(日本尼康)。

1.5 樣本收集與處理 實驗第4、8、12周末各隨機抽取B組2只大鼠禁食不禁水12 h后處死，抽取約5～8 ml下腔靜脈血,以3000 r/min離心5 min，離心出血清儲存在-80 ℃冰箱，測血清 ALT、AST、GGT、TG、LDL、TC、GLU、INS水平；迅速完整分離出肝臟，肉眼觀察肝臟大體形態及顏色,取肝臟組織固定，常規脫水，石蠟包埋，HE染色；第12周末B組大鼠建模成功，禁食12 h后處死A組和C組全部大鼠，血樣處理同B組第4、8周末；取肝臟、胰腺、腎臟組織固定，常規脫水，石蠟包埋，制作病理切片，HE染色觀察肝細胞、腺泡細胞以及胰島變化情況，PAS染色和免疫組織化學desmin蛋白染色觀察腎小球和足細胞變化情況。由經驗豐富的2名病理醫師通過光學顯微鏡進行雙盲性觀察。每張肝組織HE切片隨機進行5個視野觀察,并對肝組織脂肪變、炎癥程度、氣球樣變評分。其中,肝組織的脂肪變診斷參考《非酒精性脂肪性肝病中西醫結合診療共識意見(2017年)》[5]進行NAFLD活動度積分(NAS)和肝纖維化分期。

1.6 檢測指標和方法 血液在室溫下自然凝固10～20 min并離心約20 min(2000～3000 r/min)。收集上清液，按ALT、AST、GGT、LDL、TG、TC、GLU、INS Elisa 試劑盒說明進行操作，計算胰島素抵抗指數HOMA-IR，HOMA-IR=GLU×INS/22.5。

1.7 Desmin蛋白表達測定 采用免疫組化平均光密度值半定量分析方法測定desmin蛋白在腎臟表達水平：每組內每張切片隨機挑選3個400倍視野進行拍照。應用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統一標準，對每張照片進行分析得出每張照片陽性的累積光密度值(IOD)以及組織的像素面積(AREA)。并求出平均光密度值(average optical, AO值)，AO=IOD/AREA，AO值越大表明陽性表達水平越高。

1.8 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠血清生化指標變化 C組大鼠血清ALT、GGT、TG、TC、LDL、GLU、INS、HOMA-IR水平及肝臟病理評分均高于A組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表1)。

表1 A組與C組各項指標的比較

2.2 NAFLD大鼠臟器病理改變

2.2.1 肝臟組織病理學變化 A組第12周末：肝小葉結構完整清晰，肝細胞沿中央靜脈呈放射狀整齊排列，肝細胞形態規則，細胞之間界限清楚，肝細胞核居中，胞漿內未見脂肪空泡，匯管區無炎癥細胞浸潤(圖1a)；B組第4周末：肝小葉結構仍可見，部分肝細胞胞漿內出現較小的脂肪空泡，匯管區無明顯炎癥細胞浸潤(圖1b)；B組第8周末：肝小葉結構部分消失，大部分肝細胞胞漿內出現大小不等的脂肪空泡，細胞之間界限模糊不清，肝竇變窄，匯管區逐漸出現炎癥細胞浸潤(圖1c)；C組第12周末：幾乎全小葉內出現肝細胞脂肪變性，胞漿內可見較大脂肪空泡，匯管區可見大量炎癥細胞(圖1d)。

注：a，A組第12周末；b，B組第4周末，箭頭所示：肝細胞輕度脂肪變，胞漿內可見小的脂肪空泡，匯管區無明顯炎癥細胞浸潤；c，B組第8周末，箭頭所示：肝細胞中度脂肪變，胞漿可見大小不等的脂肪空泡，細胞界限不清，匯管區可見炎癥細胞浸潤；d，C組第12周末，箭頭所示：肝細胞嚴重脂肪變，肝細胞胞漿內可見大泡性脂肪空泡，匯管區可見大量炎癥細胞浸潤。

圖1肝組織病理圖片(HE染色，×400)

2.2.2 腎臟組織病理學變化 A組第12周末：腎小球毛細血管基底膜完整清晰，無增厚，腎小球毛細血管袢呈分葉狀，系膜區無增生，腎小球囊腔清晰，腎小管上皮細胞排列整齊，管腔清晰可見(圖2a)；C組第12周末：PAS染色陽性物質明顯增多，腎小球體積增大，腎小球囊腔變窄；腎小球毛細血管基底膜增厚，系膜區增生明顯；腎小管上皮細胞腫脹，管腔狹窄(圖2b)。

正常情況下，desmin僅在系膜細胞少量表達，在足細胞不表達，當腎小球受到各種損傷因素刺激時，desmin發生表型轉化并大量表達。 圖像分析結果顯示，腎小球足細胞Desmin蛋白表達增強(圖2c、d)。

注:a，A組第12周末(PAS，×400)；b，C組第12周末(PAS，×400),箭頭所示：PAS染色陽性物質明顯增多；腎小球毛細血管基底膜增厚，系膜區增生明顯；腎小球體積增大，球囊變小；腎小管上皮細胞腫脹，管腔狹窄;c，A組第12周末(Desmin蛋白，×400);d，C組第12周末(Desmin蛋白，×400)，箭頭所示：腎小球可見Desmin蛋白(棕黃色陽性物質)表達增多。

圖2腎臟組織病理圖片

2.2.3 胰腺組織病理學變化 A組第12周末：胰腺腺泡及胰島結構完整，腺泡細胞及胰島細胞排列整齊，未見炎癥細胞浸潤。C組第12周末：胰腺腺泡細胞開始出現凋亡，萎縮，胰島細胞未見異常(圖3a、b)。

注：a，A組第12周末;b，C組第12周末，箭頭所示：腺泡細胞開始出現凋亡，萎縮，胰島細胞未見異常。

圖3胰腺組織病理圖片(HE染色,×400)

3 討論

NAFLD的特征在于脂肪在肝細胞中以含有TG的脂滴形式積累。以TG這種形式積聚被認為是發揮脂毒性之前對機體的一種保護方式。當TG的大量積聚超過肝臟代謝能力時會引發肝臟一系列氧化應激和炎癥反應。NAFLD時肝臟脂質代謝產物增多(如二酰甘油、棕櫚酸酯、神經酰胺等)損傷肝細胞，并激活炎癥細胞通路(如內質網應激、氧化應激等)，使炎癥級聯反應放大，導致NAFLD向NASH轉化進而促進疾病發展[6]。可見，氧化應激和炎癥反應是脂毒性的重要結果。對轉氨酶的分析，轉氨酶異常提示肝臟的炎癥反應及損傷程度。由于ALT主要存在肝細胞胞漿內，當肝臟發生炎癥、壞死等損害使肝細胞膜通透性改變時，ALT從細胞內溢出到血液中。本研究發現C組ALT明顯高于對照組(P<0.05)，說明C組大鼠肝細胞受到了嚴重損害，考慮與NAFLD時血漿游離脂肪酸增加，脂肪酸β氧化也相應增加，其代謝產物的增多以及炎癥介質的釋放，觸發絲裂原活化蛋白激酶通路和核轉錄因子NF-κB通路活化[7]，啟動細胞傳導通路，出現氧化應激反應，導致肝細胞功能受損甚至壞死，而壞死的細胞進一步使炎癥細胞侵入肝實質，進而導致NASH發生有關。因此，氧化應激是NASH的主要驅動力之一。正常情況下，當肝細胞受損時，ALT首先釋放入血，當肝細胞嚴重損傷，危及線粒體時，AST也釋放入血。當AST增高超過ALT時，提示病變的慢性化和進展性[8]。本研究發現C組AST高于A組,但無統計學差異，但同時發現AST水平明顯高于ALT，提示疾病可能向肝硬化方向進展。GGT 是在腎臟、胰腺、肝臟、脾臟等組織中發現的微粒體酶，腎內含量最多，其次是胰腺和肝臟[9]。生理條件下，血清中GGT是谷氨酰循環中的關鍵酶，主要來源于肝臟內的肝內膽管上皮和肝細胞胞漿[10],參與谷胱甘肽的代謝。本研究發現C組大鼠的血清GGT水平明顯升高(P<0.05)，表明肝細胞受到了嚴重損害，考慮與血漿游離脂肪酸增多，使活性氧產生增多，從而促使肝細胞膜通透性改變，致使肝細胞受損有關。對血脂的分析，本研究發現C組SD大鼠與A組大鼠相比，C組TG、LDL、TC均明顯高于A組(P值均<0.05)，提示脂質代謝紊亂,考慮原因為過度高脂飲食攝入使肝臟內脂質過多積聚,脂肪組織的再分解或合成的游離脂肪酸增多，肝臟脂類代謝能力進一步減弱，導致肝臟發生炎癥壞死甚至纖維化；另外，由于高血糖可以促進新生脂肪的生成以及胰島素通過激活轉錄因子固醇調節元件結合蛋白1c調控新生脂肪生成[11]，提示作為NAFLD主要發病機制之一的胰島素抵抗，也可能參與了脂質代謝紊亂。

最新一項隊列研究[12]表明，NAFLD能促進晚期慢性腎臟病的進展。本研究發現高脂飲食所致的NASH模型影響大鼠腎臟組織學改變。本研究發現C組大鼠與A組大鼠相比，PAS染色顯示腎小球體積增大，腎小球毛細血管基底膜增厚，系膜區增生明顯，腎小管上皮細胞腫脹，管腔狹窄；可能與致動脈粥樣硬化性血脂異常導致腎臟內皮細胞功能障礙和腎臟血管損傷有關，至于是否與足細胞胰島素抵抗以及氧化應激有關今后仍需進一步的研究證實。其次，低密度脂蛋白氧化產生的氧化低密度脂蛋白有細胞毒性作用[13]，會刺激系膜細胞增生，損傷腎臟內皮細胞，增大細胞通透性，增加細胞基質的分泌，漸而出現腎小球硬化，最終成為慢性腎臟病發生發展基礎。C組大鼠與A組大鼠相比，免疫組化Desmin蛋白表達增加，但無統計學差異。由于正常腎臟幾乎不表達Desmin蛋白，只有少數系膜基質表達；當腎小球足細胞受損時，Desmin蛋白表達明顯增加。因此，Desmin蛋白為足細胞損傷的標志蛋白之一[14]。既往研究[15]表明，腎臟足細胞是胰島素的敏感細胞，胰島素抵抗會導致腎臟結構及功能障礙。一方面，胰島素對腎小管有保鈉作用，高胰島素血癥時，通過激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統、交感神經系統促進腎臟血流動力學改變繼而導致腎臟損害[16]。另一方面，足細胞通過胰島素信號傳導通路維持腎臟功能，Saleem等[17]研究發現，敲除小鼠足細胞胰島素特異性受體會導致蛋白尿和腎小球硬化。所以，猜測胰島素抵抗可能參與本研究足細胞損傷過程。由于國內外相關文獻報道較少，仍需大量體外實驗及動物實驗證據支持。腎臟的組織學活檢對明確二者之間關系提供一定幫助，可進一步闡述其具體發病機制，進而為臨床醫生提供新思路。

“脂肪胰” 以胰腺脂肪浸潤或脂肪變為主要表現，近年來逐漸成為學者們關注的熱點。最新研究[18]表明，利用3-T磁共振成像，質子密度脂肪分數可以較好的評價胰腺脂肪含量，并且是一種極具應用前景的可以預測胰腺脂肪含量與胰腺癌之間關系的影像學檢查。與NAFLD相比，脂肪胰的病理生理機制尚不明確。相關研究[19-20]表明，NAFLD和非酒精性脂肪胰與肥胖密切相關，且常常并存。Wang等[21]通過一項大規模橫斷面研究，首次發現調整肥胖、相關心血管危險因素等后,NAFLD仍與脂肪胰獨立相關。也有研究[22]發現,脂毒性可能直接介導胰腺腺泡細胞及胰島細胞病變，致使胰腺內外分泌障礙。本研究發現高脂飲食所致的NASH模型可導致大鼠胰腺腺泡細胞凋亡、萎縮，甚至壞死，尚未見明顯脂肪浸潤，胰島細胞未見明顯病變。本研究發現C組SD大鼠與A組大鼠相比，C組GLU、INS、HOMA-IR均明顯高于A組(P值均<0.05)，再次證實胰島素抵抗參與NAFLD發病機制。由于組織學表現胰島細胞未見明顯病變，可見胰島素抵抗參與發病并不是胰腺直接作用。本研究尚未發現胰腺脂肪浸潤，可能由于脂肪胰建模時間比NASH更長。對于脂肪胰與胰島細胞功能之間關系目前尚無定論[23-24]，是否與胰島素抵抗有關今后仍需大量研究進一步證實。

綜上所述，NAFLD可導致肝外臟器如腎臟、胰腺病變，為此不僅要重視肝臟本身病變，也要重視肝外臟器損傷，這對于預防NAFLD潛在的并發癥至關重要。