丙泊酚中/長鏈脂肪乳注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的干擾試驗

丁麗燕

摘 要 目的：開展干擾試驗研究，確定丙泊酚中/長鏈脂肪乳注射液細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查方法。方法：按中國藥典2015年版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法第一法（凝膠法），對3批產(chǎn)品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗。結(jié)果：丙泊酚中/長鏈脂肪乳注射液稀釋至105.6倍時，對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法無干擾作用。經(jīng)檢測，3批產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素均符合要求。結(jié)論：凝膠法可用于丙泊酚中/長鏈脂肪乳注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并可為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾試驗提供數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞 丙泊酚中/長鏈脂肪乳注射液 細(xì)菌內(nèi)毒素 干擾試驗

中圖分類號：R927.12； R971.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2020）01-0070-04

Interference study of bacterial endotoxin test in propofol injection

DING Liyan*（Shanghai Joy Biopharm CO.， LTD.， Shanghai Engineering Research Center of Lipid Emulsion， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To study the interference of bacterial endotoxin test in propofol medium and long chain fat emulsion injection and establish a method for bacterial endotoxin test. Methods： The inference of bacterial endotoxin test in 3 batches of products were determined based on the Chinese Pharmacopoeia （2015 edition） . Results： Propofol medium and long chain fat emulsion injection did not interfere with the bacterial endotoxin test when it was diluted to 105.6 folds with bacterial endotoxin water. The bacterial endotoxin in the 3 batches of products met the requirements after determination. Conclusion： Gelation assay can be used for detecting the bacterial endotoxin in propofol medium and long chain fat emulsion injection and can provide data support for interference tests of bacterial endotoxin inspection.

KEy WORDS propofol medium and long chain fat emulsion injection； bacterial endotoxins； interference test

丙泊酚（2，6-二異丙基苯酚），作為一種靜脈麻醉藥，以其起效迅速、作用時間短、清醒快、易于控制和不良反應(yīng)少等特點，被麻醉醫(yī)師廣泛用于全麻誘導(dǎo)，硬膜外麻醉輔助鎮(zhèn)靜，無痛人流，無痛胃鏡等領(lǐng)域。其術(shù)后惡心、嘔吐率低等優(yōu)點，進(jìn)一步奠定其門診手術(shù)首選全麻藥物的地位[1-2]。在腹腔鏡、宮腔鏡等短小手術(shù)的應(yīng)用中，其麻醉深度的良好控制性和蘇醒迅速、平穩(wěn)已被廣泛認(rèn)同。丙泊酚具有降低顱內(nèi)壓，腦代謝，抗氧化作用，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)外科麻醉[3-4]。

含藥靜脈注射用脂肪乳劑中，大部分藥物分布在油相或油水界面，避免與水直接接觸。對于易水解或?qū)λ舾械乃幬?，這種隔離起到了增加穩(wěn)定性的作用。靜脈注射用脂肪乳劑不含或僅含少量有機(jī)溶劑，對血管刺激性較??；同時，外水相中藥物較少，可有效降低由藥物引起靜脈炎的可能，增強(qiáng)患者的順應(yīng)性；另外，靜脈注射用脂肪乳劑具有一定的靶向性，可降低非靶區(qū)藥物的濃度。丙泊酚中/長鏈脂肪乳注射液游離藥物濃度和注射疼痛發(fā)生率較長鏈脂肪乳顯著降低，且在長期輸注過程中不易引起高脂癥的發(fā)生，還可減輕肝臟負(fù)擔(dān)，更適用于肺功能不全的患者和嬰幼兒麻醉，是目前市場上最安全有效的丙泊酚制劑[5-6]。

目前法定的熱原檢查方法有家兔熱原檢查法和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。家兔法存在操作繁瑣、重復(fù)性差、靈敏度低、費(fèi)時等缺點，而細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法操作簡單，靈敏度高，干擾少，速度快[7]。美國藥典20版（USPXX）第一次收載細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（bacterial endotoxin test， BET），隨后英、德、意、日以及中國相繼在藥典中收載BET法。《中國藥典》2005年版BET法檢查品種增至168個，《中國藥典》2010年版又新增修訂品種達(dá)112種，《中國藥典》2015年版BET法檢查品種增至631種?？梢娪眉?xì)菌內(nèi)毒素檢查法替代家兔熱原檢查法是一種趨勢。本文參照《中國藥典》2015年版四部“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”[8]和相關(guān)文獻(xiàn)，通過試驗研究，建立了一種可用于丙泊酚中長鏈脂肪乳中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HH·W21·600電熱恒溫水溫箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）、XW-80A旋渦混合器（上海醫(yī)大儀器有限公司）、SW-CJ-1FD（蘇州凈化設(shè)備有限公司），試驗所用玻璃器皿均在250 ℃烘烤2 h，以去除可能存在的外源性細(xì)菌內(nèi)毒素。

1.2 試藥

鱟試劑（TAL，湛江安度斯生物有限公司，靈敏度0.25 EU/ml、0.03 EU/ml）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE，湛江安度斯生物有限公司，10 EU/支）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，湛江安度斯生物有限公司，5 ml/支）；丙泊酚中/長鏈脂肪乳注射液（上海喬源生物制藥有限公司，20 ml∶200 mg，批號：BZA171001A、BZA171002A、BZA171003A）。

1.3 方法

1.3.1 干擾初篩試驗

1）供試品限值 丙泊酚中/長鏈脂肪乳注射液細(xì)菌內(nèi)毒素限值L= K/M=5/15=0.33 EU/mg。式中，K為人每千克體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/（kg·h）表示，注射劑K=5 EU/（kg·h）；M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，以mg/（kg·h）表示，根據(jù)丙泊酚中/長鏈脂肪乳注射液原研產(chǎn)品（B. Braun Melsungen Ag）的說明書，M=15 mg/（kg·h）。

2）最大有效稀釋倍數(shù)（MVD） MVD=CL/λ，C為供試品溶液的濃度，丙泊酚中/長鏈脂肪乳注射液濃度為10 mg/ml，L=0.33 EU/mg。當(dāng)靈敏度λ為0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 EU/ml時，所對應(yīng)的MVD分別為6.6、13.2、26.4、52.8、105.6倍。

1.3.2 干擾預(yù)試驗

取批號為BZA171002A的供試品，用BET水分別稀釋至6.6、13.2、26.4、52.8、105.6倍的系列溶液，作為供試品陰性對照（A）。另制備同樣倍數(shù)的供試品系列溶液，分別加入含有2λ（λ：0.25 EU/ml）的細(xì)菌內(nèi)毒素，作為供試品陽性對照（B）。設(shè)立陽性對照（C）管和陰性對照（D）管。每個濃度平行做兩管，加入鱟試劑反應(yīng)管，（37±1）℃反應(yīng)（60±2）min。

1.3.3 干擾試驗

根據(jù)干擾初篩試驗的結(jié)果，選擇第二個出現(xiàn)陽性結(jié)果的供試品濃度作為干擾試驗（一般不選擇第一個出現(xiàn)陽性結(jié)果的供試品濃度作為干擾試驗）。用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水分別將供試品溶液稀釋至第二個出現(xiàn)陽性結(jié)果的供試品濃度（A），平行做2管（A）。用A溶液將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成含2λ、1λ、0.5λ、0.25λ（λ：0.03 EU/ml的系列溶液，及每個濃度（B）。用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成含2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的系列溶液，及每個濃度平行做4管（C）。另設(shè)立陰性對照（D），平行做兩管。

2 結(jié)果

2.1 干擾預(yù)試驗

結(jié)果顯示，溶液A、D均為陰性；溶液C均為陽性，試驗有效；溶液B系列中，本試驗中樣品的無干擾濃度為≥S52.8（表1）。第二個出現(xiàn)陽性結(jié)果的供試品濃度為S105.6，選擇S105.6作干擾試驗。

2.2 干擾試驗

干擾試驗結(jié)果顯示，供試品溶液和內(nèi)毒素檢查用水分別作為供試品陰性對照和陰性對照，結(jié)果均為陰性，ES=0.03，在0.5λ

2.3 丙泊酚中/長脂肪乳注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

取3批產(chǎn)品，使用λ為0.03 EU/ml的鱟試劑，參照《中國藥典》2015年版第四部1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法第一法（凝膠法）依法檢查[8]。結(jié)果顯示，A和D均為陰性；B和C均為陽性，試驗有效（表3）。表明這3批產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均符合規(guī)定。

3 討論

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法具有操作簡單、迅速且靈敏度高的特點，適用于注射劑生產(chǎn)過程中的熱原控制和家兔法不能檢測的某些細(xì)胞毒性藥物制劑。但它的試驗結(jié)果會受到鱟試劑、生產(chǎn)工藝、處方配比、試驗環(huán)境或供試品稀釋方式等多種因素的影響而發(fā)生變化，不同廠家的相同品種對其細(xì)菌內(nèi)毒素檢查所產(chǎn)生的干擾情況也存在較大的差別，因此，進(jìn)行干擾試驗是必要的[9-11]。本研究僅對一個廠家的鱟試劑和細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、特定生產(chǎn)工藝的產(chǎn)品、供試品稀釋方式等因素進(jìn)行了干擾試驗，建議對不同廠家鱟試劑和細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、不同廠家的相同品種進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒性檢測前都需進(jìn)行干擾試驗，以獲得更準(zhǔn)確、更可靠的試驗結(jié)果，保障產(chǎn)品的安全。

本研究采用靈敏度為0.03 EU/ml的鱟試劑，對3批丙泊酚中長鏈脂肪乳注射液進(jìn)行試驗。從干擾試驗可知，Et/Es在0.5～2之間，稀釋105.6倍的丙泊酚中/長鏈脂肪乳注射液對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查沒有干擾，表明此法可行。

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