銅綠假單胞菌轉錄因子PsrA全局調控研究進展

李嬋嬋， 王 茹， 羅文英

（廣東醫科大學附屬醫院，廣東 湛江 524001）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是引起院內感染主要的革蘭陰性桿菌，為人體最重要的條件致病菌之一，可引起機體多系統、多臟器和多部位的感染。2015年全國細菌耐藥性監測網對全國1 338所醫院上報的非重復細菌調查發現：革蘭陰性菌中PA位居第三，僅次于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌[1]。如此高的耐藥率，主要與它的生物膜形成有關。PA能產生多種致病物質，主要是內毒素、外毒素、蛋白分解酶和殺白組胞素，其致病特點是引起繼發感染，多發生在機體抵抗力降低時，如大面積燒傷、長期使用免疫抑制劑等。臨床上常見的有皮膚和皮下組織感染以及中耳炎、腦膜炎，呼吸道感染、尿道感染和血流感染等。

PA的生物膜、毒力及其生長受多個基因調控，信號通路復雜。有研究發現，TetR家族中細菌PsrA轉錄因子是其中重要的因素[2]，參與了PA侵襲、附著、蜂動能力與毒力因素的調節。TetR家族是細菌適應環境的一種機制，主要通過TetR轉錄因子的抑制或激活調控基因表達，進而控制自身對于不同外部條件的適應[3]，大多數細菌的轉錄因子PsrA含有2個結構域：一個是接受信號的結構域，另一個是DNA結合的結構域[4]。本文就PA轉錄因子PsrA的致病機制進行綜述，以期為開發有針對性的藥物提供理論依據。

1 長鏈脂肪酸（long-chain fatty acid，LCFA）通過PsrA調控生物膜和毒力因子釋放

1.1 PA通過肺泡活性物質獲取營養，利用外源LCFA作為碳源適應肺部生長環境

1.1.1 PA對于LCFA的趨向性 PA對相應長度的LCFA（如油酸）具有明顯的趨向性。PA的進化系統十分復雜，有鞭毛的PA可以在液體中移動，菌毛則可以幫助PA在固體表面（瓊脂或人體組織）上滑動和蠕動[5]。有鞭毛的PA可以利用Ⅳ型菌毛（type Ⅳ pili，T4P），通過菌毛附肢的延伸，附著在固體基質上，通過回縮有效地幫助細菌穿過固體表面，T4P還參與各種功能，包括微菌落形成、生物膜啟動和遠程電子轉移。

有研究發現，鞭毛和T4P在相應的液體或固體中運動，往往有其各自的趨向性（如氧張力、pH和特定的化學物質），磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿是PA運動的趨化劑。在營養采集、生物膜和毒力形成過程中，PA都展現了T4P趨向LCFA的作用[5]。另一方面，在PA感染的人支氣管肺泡灌洗液的脫落細胞提取物中，各種獨立的分離物也同樣表現出對磷脂酰乙醇胺的誘導趨化性。

1.1.2 PA的外源性LCFA來源 肺泡活性物質是PA重要的外源性LCFA來源。哺乳動物的肺被肺表面活性劑包裹，該表面活性劑由大約10%的蛋白質和90%的脂質組成，其中大約80%的肺表面活性劑的脂質為磷脂酰膽堿[6]。PA產生磷脂酶C和脂肪酶，可以將外源磷脂酰膽堿分解為3種成分：磷酸膽堿頭基、甘油和2個LCFA[7]。而肺部囊性纖維化過程中，PA通過獲取磷脂酰膽堿進行代謝生長，達到很高的細胞密度，具體過程為：通過細菌磷脂酶C和脂肪酶對磷脂酰膽堿進行酶切，釋放出磷酸膽堿的頭基、甘油分子和2個LCFA。目前已鑒定出5種潛在的脂肪酸降解的操縱子（相關fadBA-操縱子fadBA1～5）[8]。這一脂肪酸降解途徑是通過外膜轉運蛋白FadL和內膜相關的CoA連接酶對LCFA進行跨細胞膜轉運。在攝取LCFA后，LCFA有2個去向：一是通過β-氧化途徑降解，并通過三羧酸循環成為能源/碳源；二是作為膜磷脂生物合成的前體[6]。在細菌磷脂酶C和脂肪酶對磷脂酰膽堿進行的酶促裂解釋放的3種成分中，LCFA被高度還原，并產生最多的碳和能量。在PA龐大的毒力因子庫中，大多數僅在高細胞密度復制過程中表達，且受喹諾酮信號調控[6]。因此，肺泡活性物質不僅可作為PA的趨化劑，還為PA生長提供碳源，與PA的生物膜、毒力因子生成有關。

1.2 LCFA通過PsrA調控fadBA5 β-氧化操縱子、RpoS和Ⅲ型分泌物exsCEBA-Operon的表達

1.2.1 PA PsrA響應LCFA的信號調節fadBA5 β-氧化操縱子 有研究發現，在感染PA的急性肺炎小鼠模型中，鞘氨醇和磷脂酰膽堿都發揮了重要的作用，其中磷脂酰膽堿組分LCFA的降解可能通過3種不同的β-氧化途徑發生，涉及3個fadBA操縱子（fadAB1-PA1737和PA1736、fadAB4-PA4786和PA4785、fadBA5-PA3014和PA3013）[9]。其中，fadBA5操縱子對LCFA信號有反應，在PsrA存在的條件下可被LCFA誘導，使LCFA與PsrA結合，進而抑制fadBA5[10]。

為了使外源脂肪酸能在PA內被降解，必須首先通過膜轉運蛋白將其轉運到細胞內，然后通過脂肪?；o酶A合成酶在三磷酸腺苷和輔酶A的參與下活化脂肪酸。活化的脂肪酸可進入β-氧化途徑。在不存在脂肪酸的情況下，轉錄因子FadR會抑制編碼β-氧化所需酶（FadL、FadD、FadE和FadBA）的基因[11]。

1.2.2 LCFA通過PsrA調控RpoS和Ⅲ型分泌物exsCEBA-Operon 在小鼠感染模型中，PA發揮感染、毒力作用最強的為Ⅲ型分泌系統（type Ⅲsecretion system，TTSS）。TTSS是一種專門的蛋白質分泌裝置，由25個以上的基因編碼，在被激活時，TTSS分泌效應分子進入宿主細胞的細胞質中，導致靶細胞功能障礙或死亡[12]。

TTSS和效應基因由轉錄因子ExsA結合其共有序列（TNAAAANA）大約50個堿基而被激活[13]。調控蛋白ExsD是一種抗激活劑、負調節劑，可與ExsA結合并阻止其激活TTSS基因轉錄。蛋白ExsC通過直接結合ExsD，阻斷ExsD與ExsA作用[13]。當TTSS通道關閉時，ExsE與ExsC結合，但是有信號激活時，ExsE可被分泌到胞外，從而使ExsC可以自由地與ExsD相互作用并釋放ExsA，最后ExsA激活TTSS表達[13]。然而，除ExsD外，蛋白ExsA、ExsC和ExsE的基因都位于同一個操縱子exsCEBA中[14]。

exsCEBA啟動子的活性決定了exsCEBA對TTSS具有重要的調控作用。而PsrA可以與exsCEBA啟動子結合。有研究發現，PsrA是exsCEBA以及TTSS效應子（如exoS）完整表達的必要條件[14]。DNA結合研究結果證實，LCFA抑制了PsrA與rpos和exsC啟動子區域結合，LCFA通過PsrA直接影響這2個基因的激活[14]，且這種影響在細菌培養的整個對數期均保持較高水平。存在LCFA的情況下，PsrA-LCFA復合物使PsrA脫離exsC和rpoS基因的啟動子，exsC和rpoS表達下降。

大量的毒力決定因子（LasA/LasB蛋白酶、堿性蛋白酶、磷脂酶、脂肪酶、外毒素A、Ⅲ型切片外酶S/T/U/Y、鼠李糖脂、藻酸鹽和氰化氫合成等）與PA的TTSS有關[15]。而細菌獲得營養對細菌毒力因子的形成非常重要，因為細菌的毒力表達和營養物獲得（如碳源）之間存在相互作用，獲得營養是毒力因子產生的前提。肺泡表面活性物質作為一種外源LCFA來源，是細菌生長的重要營養物質，在PA生長中起重要作用。PA通過PsrA的表達直接利用肺泡表面活性物質影響毒力因子的生成。

2 PsrA調控PA耐藥性及生物膜的形成

2.1 PA通過PsrA對陽離子型抗菌肽（cationic intrinsically disordered antimicrobial peptide，CIDAMP）的誘導，參與內在多黏菌素和抗菌肽抗性

2.1.1 CIDAMP的結構 抗菌肽作為重要的先天免疫劑，存在于植物、昆蟲與哺乳動物體內。因此，抗菌肽被越來越多地用作前瞻性抗菌藥物的模板，也被稱為CIDAMP。它們的特征在于具有正凈電荷及適度長度，并具有良好的水溶性。陽離子型抗微生物肽會結合并穿透細菌細胞膜，通過物理破壞，導致細菌細胞膜裂解，最終導致細菌細胞死亡，可替代常規抗菌藥物。這些CIDAMP的優勢在于：（1）與人宿主的兩性離子哺乳動物膜相比，它們對帶負電荷的細胞膜具有高度選擇性；（2）由于肽通過物理作用破壞細胞而發揮功能，因此在靶向方面沒有特異性膜，一般不會引起細菌耐藥[16]。

有研究發現，有些氨基酸殘基會促進有序蛋白變成結構混亂的無序蛋白，即使在包含了促進蛋白質結構無序化的氨基酸實驗中，線性陽離子肽都是有效的殺菌劑，因此該離子肽效應與氨基酸序列無關[16]。這些CIDAMP的抗菌活性取決于肽鏈長度、凈電荷、脂化作用和環境條件，影響病程發展的簡單氨基酸序列，或者幾乎天然存在的氨基酸序列都可以刺激產生大量的CIDAMP[17]。這些是針對PA、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和真菌等各種細菌病原體的潛在的新型抗菌藥物。

2.1.2 CIDAMP 具有正常皮膚的健康人很少發生PA感染，PA的潛在抗菌肽來源可能是內分泌汗腺，這些汗腺產生了汗液特異性抗菌肽皮膚鐵蛋白[17]。有研究發現，CIDAMP是高效的PA靶向肽抗菌藥物，并且對人體具有較低的細胞毒性。PA的psra基因是對陽離子抗微生物劑的抗性和毒力特征的重要調節劑，介導陽離子肽抗性和某些與毒力相關的過程，如生物膜形成、快速附著和成群運動[18]。

多黏菌素是治療耐藥性PA最后的選擇[19]，而psra轉錄可以調節抗菌肽的激活，對內在的抗菌肽和多黏菌素B抗性形成都有貢獻。在psra突變體中，PA外膜的通透性改變，加強聚陽離子分子（如多黏菌素B和抗菌肽）透過外膜進入胞內。具體過程為：聚陽離子分子與膜上脂多糖的二價陽離子結合位點相互作用[20]，導致膜發生滲透損傷而攝入大量的聚陽離子分子，而多黏菌素B和抗菌肽被證實在psra突變體中滲透更高[18]。

2.2 PsrA通過調節LexA蛋白來介導1類整合子整合酶基因的表達

2.2.1 LexA蛋白與1類整合子 LexA是調節細菌應激反應途徑的阻遏蛋白，能在不同種類細菌之間轉錄調控，調控細菌對抗菌藥物的耐藥性。應激情況下，LexA蛋白可被水解，使應激反應性基因被抑制。LexA失活的菌體對抗菌藥物的耐藥性顯著降低，并且對傳統的抗菌藥物也高度敏感[21]，RpoS和PsrA蛋白在LexA蛋白質對整合酶轉錄的調控中起到調節作用。

PA在進化過程中存在信息交流行為[22]，1類整合子能在細菌間快速傳播，被認為是影響抗菌藥物抗性基因編碼的重要因素[23]。在整合子的快速傳播作用下，多重耐藥PA在臨床環境中有增加的趨勢，幾乎50%的多重耐藥PA攜帶整合子。根據intI基因序列的差異，整合子分為幾個不同的類別，第1～3類是重要的可移動元件，主要通過質?；蜣D座子傳播。整合子中的基因讓PA獲得了β-內酰胺類、氨基糖苷類、氯霉素、磺胺類、甲氧芐啶、紅霉素、喹諾酮類、磷霉素、季銨化合物防腐劑和其他臨床常用抗菌藥物的抗性。

2.2.2 細菌通過PsrA影響RpoS調節LexA蛋白與intI基因表達 細菌經常暴露在不穩定的環境中，通過各種基因表達使自身達到與環境相適應的狀態。暴露于多種環境壓力下，還可能產生有毒化合物，這些化合物可能對細菌本身有害。因此，PA產生了一套適應和克服外部和內部有害影響的機制。在刺激性環境中，應激系統會被激活，以維持基因組完整性，并維持PA較好的生長狀態。 LexA蛋白可通過對RNA聚合酶的變構干擾來抑制細菌的應激反應。當感染PA時，應激系統被激活，LexA蛋白水解失活和intI1基因表達被激活。RpoS是這些應激反應的中心調節因子，主要監管機構是PsrA，而PsrA主要通過影響調節信號——喹諾酮信號來影響RpoS的形成[21]。

2.3 PA PsrA通過喹諾酮信號調控生物膜形成

細菌生物膜的細胞外聚合物質可作為基質將細菌細胞保持在一起。PA的細胞外聚合物生物膜是多糖、核酸和蛋白質的混合物。生物膜發育不同階段的多糖合成位點（胞外多糖Psl）的產物肉眼可見，在附著過程中，胞外多糖Ps1以螺旋狀錨定在細胞表面，促進細胞間的相互作用和基質的形成，生成的基質將細菌保留在生物膜中。在生物膜成熟過程中，胞外多糖Psl會積聚在微菌落的外圍，從而在微菌落中心形成無Psl基質的空腔。在分散階段，活動力強的細胞、死細胞和細胞外DNA被釋放到空腔中進行播散[24]，進而成為PA生物膜形成的機制——建立基質，然后形成1個空腔，最后釋放細胞播散[25]。

PA擁有一個復雜的群體感應（quorum sensing，QS）網絡，該網絡由4個系統組成，控制著細菌的相互作用和毒力因素的表達，如毒力因子、成群的運動力和生物膜。其中喹諾酮信號系統生成PA喹諾酮信號（Pseudomonas aeruginosaquinolone signal，PQS），通過激活pqsABCDE操縱子形成正反饋回路，生成更多的PQS[26-27]。

PQS生物合成首先由一種鄰氨基苯甲酸輔酶—A PqsA連接酶開始[28]。PqsA通過CoA收集鄰氨基苯甲酸以形成茴香酰-CoA，丙二酰-CoA通過PqsD的作用，被PqsB和PqsC催化與辛酰基輔酶A結合形成2-庚基-4-喹諾酮[29-30]。最后單加氧酶PqsH催化2-庚基-4-喹諾酮形成PQS。有研究發現，PsrA通過脂肪酸β-氧化途徑，抑制PA0506的轉錄，進而正向影響PQS產生，使得酰基輔酶A化合物向烯酰輔酶A化合物的轉化減少，從而允許部分辛酰輔酶A逃脫β-氧化途徑并形成PQS[31]。

PQS除作為QS信號分子發揮作用外，還可介導鐵吸收，與生物膜、細胞毒性、外膜囊泡有關[32]。PsrA在影響PQS形成的同時，也影響了PA生物膜的形成[33]。

3 結論與展望

PsrA不但與PA的生物膜形成有關，還與其耐藥性、細胞毒性、主動免疫活動有關。一般情況下，PsrA能以協作的方式發揮作用，使其立即參與免疫保護和營養獲取。PsrA的產生可能會改變細菌種群的整個結構，從而提高其在多種環境中的適應性，并建立起對環境壓力的抵抗力。此外，我們推測PsrA仍然存在未知的功能，因此有必要進行更多的研究，以探索PsrA在開發現代生物技術和治療傳染病方面的潛在應用。