快速凝膠熒光染色法在尿液蛋白電泳分析中的應用

賈 佳， 潘 婕， 倪 軍， 王 森， 徐志曄， 柏 兵

（南京大學醫學院附屬鼓樓醫院檢驗科，江蘇 南京 210008）

尿蛋白變化通常是腎臟或其他臟器系統實質性損傷或功能性改變的反映。目前，在臨床實驗室中一般僅檢測尿總蛋白水平[1]，但這不能反映出尿蛋白的選擇性情況。實際上，在腎小球濾過增加、腎小管重吸收減少以及腎小球、腎小管損傷釋放或主動分泌等條件下，尿蛋白都會升高，并且在尿蛋白成分上出現一定的特征性。因此，除尿蛋白水平外，其成分分析對病因判斷具有重要意義。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）是蛋白成分分析的常用手段[2]，但由于考馬斯亮藍染色液在靈敏度上的局限性，制約了SDSPAGE在尿液樣本蛋白分析中的應用。SYPRO Ruby是一種可與蛋白結合的熒光染料，用于凝膠染色時，具有很高的靈敏度及較廣的線性范圍[3]。本研究利用這種新型染料對SDS-PAGE后的尿蛋白樣本進行染色，并作初步研究。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2018年10月南京大學醫學院附屬鼓樓醫院37例腎臟疾病患者的尿液，其中男20例、女17例，年齡21～72歲。另收集同期南京大學醫學院附屬鼓樓醫院8例系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者（SLE組，均為女性，年齡18～45歲）的尿液，與5名女性體檢健康者（正常對照組）的尿液作對比。

1.2 方法

1.2.1 樣本的收集和處理 留取所有對象的清潔中段尿。采用AU5800全自動生化分析儀（美國Beckman Coulter公司）檢測尿液總蛋白水平，試劑盒購自南京厄爾尼醫學科技有限公司。在尿液標本中加入4×LDS加樣緩沖液（美國ThermoFisher Scientific公司）及10 mmol/L二硫蘇糖醇（1，4-dithiothreitol，DTT）（美國Sigma-Aldrich公司），80 ℃加熱10 min后，冰上靜置1 min，20 000×g離心3 min。將1.3 g/L尿蛋白標準品（德國DiaSys Diagnostic Systems GmbH公司）用1×LDS加樣緩沖液進行倍比稀釋，按上述方法處理，上樣量為10 μL，10個孔道中的最終蛋白加樣量分別為5 000.0、2 500.0、1 250.0、625.0、312.5、156.0、78.0、39.0、20.0、10.0 ng。

1.2.2 凝膠準備與SDS-PAGE 取商品化蛋白質電泳預制膠（ExpressPlus PAGE Gel，4%～12%；南京金斯瑞生物技術公司），按說明書要求進行電泳。樣本量較多時，自備增寬凝膠。

1.2.3 考馬斯亮藍染色液染色 參照考馬斯亮藍R250染色液（含10%乙酸、50%甲醇，美國Bio-Rad公司）說明書，將已進行過電泳的凝膠染色過夜，蒸餾水脫色至條帶清晰，拍照保存。

1.2.4 常規凝膠熒光染色 將凝膠用去離子水清洗3～5次，用固定液（50%甲醇和7%醋酸）固定30 min，再用去離子水清洗3～5次，用SYPRO Ruby染色液（美國ThermoFisher Scientific公司）浸泡，輕輕搖動，室溫下避光過夜。用10%甲醇與7%醋酸的混合液清洗3次，再用清水清洗3次，拍照保存，并將圖像背景調為黑色，蛋白條帶為灰色。

1.2.5 快速凝膠熒光染色 本研究參照SYPRO Ruby染色液說明書及文獻[4]，對染色方法進行了改進。采用快速凝膠熒光染色法，染色時間縮短至15 min。具體步驟：電泳結束后，將用去離子水預洗后的凝膠放入預熱至90 ℃的去離子水中清洗3次，然后放入預熱至90 ℃的熒光染液中染色15 min，再用常溫去離子水漂洗3遍，顯像拍照，將蛋白條帶結果與染色過夜的蛋白條帶結果進行比較。

1.3 圖像處理

采用Image J軟件（美國國立衛生研究院）對凝膠上的蛋白條灰度進行定量。由于2種凝膠的條帶顏色不同，其灰度值不能直接比較，所以分別以各自的第1個尿液樣本的灰度為基準進行標準化。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。2種方法間的比較采用雙因素方差分析和post-hoc Tukey檢驗。

2 結果

2.1 SYPRO Ruby染色液染色的靈敏度

尿蛋白標準品梯度稀釋并進行SDS-PAGE后分別采用SYPRO Ruby染色液和考馬斯亮藍染色液進行染色。與考馬斯亮藍染色液染色結果相比，SYPRO Ruby染色液染色后的凝膠上可見更多清晰的蛋白條帶。當尿蛋白標準品加樣量為39.0 ng時，考馬斯亮藍染色液染色已無明顯條帶，見圖1（a）。當尿蛋白標準品加樣量為10 ng時，SYPRO Ruby染色液染色的主要蛋白（疑似白蛋白）條帶依然可見，見圖1（b）。

分別測定2種染色方法染色后的疑似白蛋白條帶的灰度值并進行標準化。結果顯示，SYPRO Ruby染色液染色后的疑似白蛋白條帶灰度值高于考馬斯亮藍染色液染色，見圖1（c）。

用1例慢性腎炎患者的尿液樣本進行重復實驗，結果與尿蛋白標準品一致，見圖2。

圖1 尿蛋白標準品SYPRO Ruby染色液染色與考馬斯亮藍染色的比較

圖2 慢性腎炎患者尿液樣本SYPRO Ruby染色與考馬斯亮藍染色液染色的比較

2.2 SDS-PAGE和SYPRO Ruby染色液染色在不同腎臟疾病患者尿液樣本分析中的應用

對37例腎臟疾病患者的尿液樣本進行SDSPAGE和SYPRO Ruby染色液染色。結果顯示，不同腎臟疾病患者之間尿蛋白成分有明顯的特征性變化，同種疾病患者尿蛋白成分不完全相同。見圖3。

對總蛋白濃度無明顯升高的SLE患者尿液標本進行SDS-PAGE和SYPRO Ruby染色液染色分析。SLE組尿液標本中大部分蛋白條帶與對照組一致，但在相對分子質量100 000處出現了一根較濃的蛋白條帶。見圖4。

圖3 不同腎臟疾病患者尿液樣本的SDS-PAGE和SYPRO Ruby染色液染色分析

圖4 SLE組與對照組尿液樣本的SDS-PAGE和SYPRO Ruby染色液染色分析

2.3 快速凝膠熒光染色法與染色過夜的蛋白條帶顯色比較

將尿液總蛋白濃度正常的患者尿液樣本分為2份，1份用快速凝膠熒光染色法進行15 min快速染色，1份染色過夜。與染色過夜的蛋白條帶相比，快速凝膠熒光染色法顯色較弱。見圖5。

圖5 快速凝膠熒光染色法與染色過夜的蛋白條帶顯色比較

3 討論

本研究采用SDS-PAGE和SYPRO Ruby染色液染色對尿液蛋白成分進行分析，并以此為基礎建立了快速凝膠熒光染色法，通過高溫加熱將染色時間縮短至15 min，這為快速凝膠熒光染色法在臨床的常規開展提供了可能。本方法可檢測到10 ng尿蛋白（加樣量為10 μL），即可檢測到1 ng/μL的尿液蛋白，可滿足臨床對尿液樣本的檢測要求。

本研究結果顯示，相同腎臟疾病的不同患者之間的尿液蛋白成分不太一致，即使尿總蛋白濃度正常，其蛋白成分卻可能已經發生了變化，說明尿蛋白成分可能與腎臟的病因關系較小，與腎臟損傷和功能狀況有更為密切的關系，提示尿蛋白成分分析對腎臟損傷和功能變化具有重要價值。本研究結果顯示，尿總蛋白正常的SLE組尿液標本中大部分蛋白條帶與對照組一致，但在相對分子質量100 000處出現了一根較濃的蛋白條帶。結合文獻報道，推測該條帶可能為尿調節素蛋白[5-6]。本方法不僅可以協助更好地判斷蛋白尿的選擇性，還可以發現更多異常出現的蛋白。

綜上所述，以SDS-PAGE和SYPRO Ruby染色液染色為基礎的快速凝膠熒光染色法在尿液蛋白分析中具有重要價值，可作為尿蛋白分析的常規方法，為疾病的診治提供更多的信息。