膝康止痛方對大鼠膝骨關節炎鎮痛作用研究

姚 旭，王清華，王 野

（遼寧中醫藥大學附屬醫院，沈陽 110847）

膝關節骨性關節炎（knee osteoarthritis,KOA），是一種以進行性關節軟骨退化，軟骨下骨改變，關節邊緣骨贅形成，滑膜組織炎癥和增生，韌帶退變和半月板以及關節囊肥大為病理特征的膝關節疾病，是常見的骨關節炎，是骨科康復的常見病[1-5]。膝關節骨性關節炎由力學和生物學因素引發的關節軟骨組織異常，以退行性關節病變為主[6]。其主要癥狀是膝關節疼痛，僵硬，可伴有腫脹，關節活動欠利等。本研究是將我科自制經驗方膝康止痛方進行初步的實驗研究，通過觀察實驗結果，為進一步臨床研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗用藥 膝康止痛方方藥組成：獨活10 g，羌活10 g，桑寄生15 g，牛膝15 g，海風藤10 g，雞血藤15 g，川芎6 g，延胡索10 g，甘草5 g。臨床服用一天半劑量，折合成大鼠等效劑量為6.6 g·kg-1·d-1，小鼠的等效劑量約為10 g·kg-1·d-1。實驗用藥制備：全部藥品購買于遼寧省中醫院大藥房。稱取藥物后，按重量：體積為1:8 的比例加水，煮沸后煎煮2 h，倒出藥液后，再重新加水煮沸后煎煮2 h，將2 次的藥液混勻后濃縮成終濃度為1.5 g·L-1的儲備液冷藏備用。

1.2 主要試劑 IL-1β ELISA 試劑盒，上海酶聯生物科技有限提供；TNF-α ELISA 試劑盒，上海酶聯生物科技有限提供；Masson 染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；醋酸：國藥集團化學試劑有限公司生產（分析純）批號：F20061101。

1.3 主要儀器 RM-2245 石蠟切片機（LEICA），ZKMIAX 顯微鏡（Olympus），Epoch 酶標儀（BioTek），冷CCD 凝膠成像系統（Image Quant 350），CMIAS 病理顯微鏡分析處理系統，eppendorf 微量移液器，1 mL和5 mL 醫用注射器等。

1.4 動物 wistar 大鼠，SPF 級，雄性，180～220 g；KM小鼠，SPF 級，18～22 g，雌雄各半，購于遼寧長生生物科技有限公司，遼寧省實驗動物質量合格證書：SCXK（遼）2015-0001。

1.5 方法

1.5.1 小鼠鎮痛實驗 小鼠正常適應性飼養3 d，按體質量隨機分為4 組。CMC 對照組：給予CMC 混懸液，阿司匹林對照組：阿司匹林，0.2 g·kg-1·d-1，膝康止痛方低劑量組：10 g·kg-1·d-1，膝康止痛方高劑量組：30 g·kg-1·d-1，12 只/組，雌雄各半。按上述各組藥物及劑量分別灌胃給藥連續3 d，2 次/d。第4 日給藥1 次30 min 后，各組小鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL/只。分別觀察記錄各組小鼠：1）扭體反應出現的時間；2）給予醋酸后20 min 內扭體反應發生次數及抑制率。

1.5.2 大鼠膝關節炎實驗 大鼠適應性飼養7 d后，按體質量隨機分組。1）正常對照組：蒸餾水1 mL·100 g-1·d-1；2）模型組：1 mL·100 g-1·d-1；膝康止痛方低劑量組：6.6 g·kg-1·d-1，膝康止痛方高劑量組：20 g·kg-1·d-1。造模方法：仰臥位固定于木板上，剪去所要注射的膝關節腔周邊1 cm 區域的腿毛，絡合碘消毒。右膝髕旁內側切口，逐層打開關節腔，將髕骨向外側推使之脫位，膝關節處于最大屈曲狀態，暴露關節腔，剪斷前交叉韌帶。正常對照組打開關節腔后不剪斷前交叉韌帶。各治療組連續給予上述藥物8周，灌胃給藥，2 次/d，1 mL·100 g-1·d-1。實驗結束后，全部動物麻醉后進行腹主動脈采血，離心后保留血清，存于-80℃冰箱中保存。病理學檢測，標本切取后立即投入10%甲醛固定48 h，后入10%甲酸溶液浸泡，連續脫鈣12 d，至組織完全脫鈣。蒸餾水浸泡，常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片6 μm，保存備用。

1.5.3 病理染色方法 HE 染色：Bounin 固定液固定48 h，經30%甲酸脫鈣 48 h 后，切片經過二甲苯梯度脫蠟，蘇木精浸染5 min，水洗，再入伊紅浸染5 min，水洗，二甲苯透明，中性樹膠封固。Masson 染色：全部標本按常規石蠟切片程序處理，7 um 厚度切片，切片移至水洗，入 PH6.0 的醋酸-醋酸鈉緩沖液浸漬 30 min（37℃），移入濃度為 0.5%的透明質酸酶消化 6 h，經水洗后，切片入 2 mol/L 氯化鈣液浸洗 48 h 再經水洗后做Masson 染色，Weigert 蘇木素A 和Weigert 蘇木素B 等比混合，染色10 min，蒸餾水洗1 min，Masson 復合染色液染色15 min，蒸餾水稍沖洗，1% 磷鉬酸液處理5 min，苯胺藍染色液復染5 min，1% 冰醋酸水處理1 min，脫水透明封片。

1.5.4 甲苯胺藍染色：甲苯胺藍染液30 min，自來水沖洗，冰醋酸分化至胞核清晰，再次自來水沖洗，風干后二甲苯透明，中性樹膠封固。病理顯微鏡拍照，每張切片選取3 個不同視野進行拍照。

2 結果

2.1 膝康止痛方小鼠鎮痛實驗結果 膝康止痛方通過預防性灌胃給藥3 天后，0.6%醋酸溶液復制小鼠疼痛模型，觀察膝康止痛方對小鼠的鎮痛作用。結果發現，溶媒對照CMC 組小鼠20 min 出現明顯的扭體反應，膝康止痛方兩個劑量組的扭體次數明顯減少，與CMC組比較，P＜0.05，具有統計學意義，見表1。

表1 小鼠鎮痛試驗（扭體法）扭體次數（，n=12）

表1 小鼠鎮痛試驗（扭體法）扭體次數（，n=12）

注：與CMC 組比較，## P＜0.01

2.2 膝康止痛方治療大鼠膝關節炎的實驗研究結果

2.2.1 大體病理觀察 末次給藥后24 h，實驗動物全部麻醉處死，分離膝關節，暴露關節面，光鏡下觀察膝關節表面完整度和損壞程度。結果顯示，正常對照組大鼠的膝關節關節面光整，色澤如常，未見明顯的損傷；模型組出現關節面粗糙，缺損或潰瘍形成，且色澤灰暗，有的甚至出現關節軟骨的剝脫；中藥治療組損傷均有所緩解。

2.2.2 組織病理學觀察結果 大鼠膝關節經過脫鈣，切片等過程后，采用了HE，masson 和甲苯胺藍染色觀察關節的損傷情況。結果發現，正常組大鼠的軟骨表面光滑完整，結構清晰，軟骨細胞排列，染色均勻，可見完整的潮線存在，未見病理系損傷（見圖1A）。模型組關節軟骨表面出現嚴重損傷，結構不完整，出現缺損或缺失，軟骨明顯變薄，結構不清，染色不均，軟骨細胞排列紊亂，總數減少，潮線扭曲不規則（見圖1B）。膝康止痛方給藥組軟骨的損傷得到不同程度的緩解，高劑量組效果更好（見圖1C，圖1D）。

2.2.3 Masson染色結果 正常組膠原纖維和軟骨呈藍色，胞漿纖維素呈紅色，胞核呈黑藍色，四層結構很清晰可以分辨，可以分清潮線；軟骨細胞染色均勻（圖2A），模型組軟骨組織表明受損，形狀不規則、缺陷，藍色的軟骨膠原減少，紅色的纖維成分增多，分布不均（見圖2B）治療組可逆轉軟骨細胞的損傷（見圖2C，圖2D）。

2.2.4 甲苯胺藍染色 軟骨、成骨細胞染色成紫藍色。正常對照組軟骨細胞和成骨細胞染成藍色，其他染成紅色。模型組軟骨結構損傷嚴重，細胞數量明顯減少。治療組損傷均有不同程度的緩解。

圖1 關節軟骨的HE 染色結果（HE，×100）

圖2 關節軟骨的Masson 染色結果（Masson，×100）

圖3 關節軟骨的甲苯胺藍染色結果（甲苯胺藍，×100）

2.2.5 病理積分統計結果 參考Markin[7]骨關節病組織評分方法，通過不同的染色方法進行病理評分。結果顯示，與對照組相比，模型組大鼠的軟骨組織表現出明顯的病理學損傷，病理學積分值均顯著增高；與模型組相比，中藥治療組的病理損傷均有明顯改善，病理學積分值均明顯降低。見圖4。

2.3 大鼠血清IL-1β、TNF-α 含量檢測 實驗結束后，將大鼠麻醉后進行腹主動脈采血，取血清后，檢測IL-1β、TNF-α 含量。結果發現，與正常組相比，模型組的IL-1β 和TNF-α 均明顯增高，P＜0.01；與模型組相比，膝康止痛方組的IL-1β和TNF-α明顯降低，P＜0.05和P＜0.01，見表2。

圖4 關節炎的病理積分結果

表2 膝康止痛方對關節炎大鼠血清中IL-1β 和TNF-含量的影響（，n=8）

表2 膝康止痛方對關節炎大鼠血清中IL-1β 和TNF-含量的影響（，n=8）

注：與對照組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

3 討論

膝骨性關節炎，中醫大致屬于“骨痹”“痹證”“膝痹”等范疇[8-9]。病因病機多因肝腎虧虛，勞傷日久，氣血不足，筋骨失養，風寒濕邪趁虛而入，氣血凝滯，經脈不通，不通則痛，發為本病。肝腎虧虛，是多種疾病發病的基本病機，補益肝腎，是治療相關疾病的基本法則[10]。本病可從本虛標實的角度辨證施治。本實驗用藥膝康止痛方是由獨活寄生湯、蠲痹湯和我院止痛散加減化裁而成，方中獨活、羌活、海風藤以祛風除濕，通絡止痛，主祛筋骨間的風寒濕邪。桑寄生、牛膝、補骨脂，補肝腎，壯筋骨，雞血藤、當歸補血舒筋，通絡止痛，川芎、延胡索行氣通絡止痛，甘草益氣調和。方中陰陽氣血調和，通脈止痛并重。諸藥共行補腎強筋，祛風除濕，化瘀止痛之用。

膝關節炎的發病與年齡，體質量指數和身體健康狀況關系密切。早期疼痛和晚期的致畸是影響患者生活質量的重要因素[11]。對于膝骨關節炎的治療，緩解骨關節炎患者的關節疼痛仍然是治療的焦點。目前臨床上用藥應用的止痛藥物主要為非甾體類抗炎藥等[12]，但是療效的同時產生諸多不良反應。近年來研究發現一些新的潛在治療關節炎的藥物，但還未在臨床應用[13]。

中醫藥治療膝骨關節炎可通過多種途徑緩解疼痛癥狀，延緩KOA 的病理進程[14-16]。膝康止痛方為我科的經驗方劑，經過多年對KOA 患者應用，能明顯緩解疼痛癥狀，提高生活質量，但其機制不清。為了觀察膝康止痛方的鎮痛作用，我們采用0.6%醋酸小鼠腹腔注射方法復制經典的疼痛模型觀察膝康止痛方鎮痛作用，從客觀的量化角度評價該方的鎮痛效果。指標實驗結果證明，膝康止痛方能顯著抑制醋酸所致的小鼠扭體反應，提示其具有顯著的鎮痛作用。

炎性細胞因子在膝關節炎的發病過程中的作用日益受到人們的關注。TNF-α 和IL-1β 等細胞因子能夠抑制軟骨細胞的合成，促進其分解。炎癥發生時TNF-α和IL-1β 受到NF-κB 和急性反應蛋白（AP）的調節，以自分泌的方式參與炎癥反應，并能促進其他細胞因子如NO，PGE2，IL-6，MMP1，MMP9 和MMP13 的合成與分泌[17-18]。

巨噬細胞存在于正常膝關節，非病理狀態下處于休眠狀態。但是炎癥存在時被激活，分泌的多種致炎細胞因子。其中TNF-α 作用最強，亦能協同其他細胞介素（如IL-1β、IL-6 等）作用，在膝骨關節炎的發生與發展中起到十分重要作用[19]。IL-1β 存在膝骨關節炎中主要IL-1 亞型，有多種細胞（如巨噬細胞，軟骨細胞、滑膜細胞等）分泌，與軟骨細胞上的受體結合后，一方面促進細胞的凋亡，另外促進基質金屬蛋白酶類（MMPs）的合成與分泌，增加軟骨細胞的降解，提高破骨細胞的活性，加重膝關節的炎癥反應[20］。中藥復方以其多藥味組合為特點，可以降低炎癥細胞因子[21]。

本研究發現在膝關節炎模型大鼠血清中的TNF-α和IL-1β 含量明顯增多，灌胃膝康止痛方后顯著降低大鼠血清中二者的含量，高劑量組作用更明顯。

綜上所述膝康止痛方具有明顯的止痛作用，能緩解膝骨關節炎的病理進程，且該作用與降低TNF-α 和IL-1β 有關。