中性粒細胞胞外陷阱在潰瘍性結腸炎中的研究進展

羅 婷， 潘秀軍

（上海交通大學醫學院附屬新華醫院檢驗科，上海 200092）

一般認為中性粒細胞通過趨化、吞噬、脫顆粒等一系列作用抵御病原微生物入侵，隨著研究的深入，發現中性粒細胞還存在另一種特殊形式的免疫應答，即通過產生中性粒細胞胞外陷阱（neutrophil extracellular trap，NET）參與機體的免疫防御[1]。最初對NET的研究主要集中在感染性疾病，后續的研究發現，NET與自身免疫性疾病的發生、發展也密切相關。潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種常見的自身免疫性疾病，中性粒細胞在UC的發病機制中發揮著重要作用[2]，但NET作為中性粒細胞發揮免疫功能的一種特殊結構，在UC發病中的作用機制尚不明確，近年來逐漸引相關研究人員的關注。我們對NET在UC發病中的研究進展作一綜述，以期對UC的診斷及治療提供進一步的理論支持。

1 UC

UC是一種以腸道慢性炎癥性病變為主要特征的自身免疫性疾病，典型的UC患者表現為便血、腹痛及腹瀉，目前內鏡檢查是診斷UC的金標準[3]。UC的發病率在全球呈逐年上升趨勢，其病因涉及遺傳、環境和免疫等多種因素[4]，但具體的發病機制尚不完全明確。已有研究結果表明，中性粒細胞在UC結腸黏膜中大量浸潤，隨著活性氧的產生和絲氨酸蛋白酶、基質金屬蛋白酶和髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）等一系列物質的釋放，細胞進入隱窩腔內形成特征性的隱窩膿腫[5]。臨床上將中性粒細胞浸潤作為UC的組織病理學標志，反映UC的黏膜破壞情況，腸黏膜組織學檢查發現中性粒細胞減少或消失可提示UC治療有效，因此可根據中性粒細胞黏膜浸潤的變化情況進行療效評估。然而，中性粒細胞在UC腸道黏膜中的確切作用機制仍不明確，NET作為中性粒細胞發揮作用的一種新形式，引起了研究者的關注[6-8]。

2 NET及其形成

1996年，TAKEI等[9]的研究發現，中性粒細胞存在一種特殊的死亡形式，這種形式有別于傳統的凋亡和壞死，在此過程中，中性粒細胞會經歷一系列的形態變化，釋放出DNA和胞內顆粒蛋白等物質并最終死亡，但產生這一現象的具體機制尚不明確。2004年，BRINKMANN等[1]詳細報道了這一過程，并首次將釋放出的特殊結構命名為NET，這是一種具有殺菌效應的含有DNA和顆粒蛋白的網狀結構。隨后的研究發現，中性粒細胞能被佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）等多種因素激活，啟動NET，即染色質解聚，分葉核特性逐漸消失，嗜天青顆粒中的彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）被釋放并移位至胞核，作用于組蛋白使其降解，隨后顆粒膜和核膜逐漸崩解，顆粒中的MPO等其他多種蛋白質進入核內，與解聚的染色質混合，最終細胞膜破裂，混合了組蛋白、NE和MPO等多種胞內蛋白質的DNA網狀纖維結構被釋放至胞外空間[10]。為了區別于細胞凋亡及壞死，這一過程被命名為NET[11]。目前的報道認為NET存在3種形式[12]：（1）自殺式NET[13]，這一過程是經還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）及PKC-Raf-MERK-ERK通路實現的，一般需要2～4 h；（2）存活式NET[14]，此類NET釋放不伴有細胞膜的破裂，由相關刺激識別Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）和補體3（complement 3，C3）的補體受體誘導中性粒細胞活化形成NET，以囊泡形式經細胞膜釋放，而活化的中性粒細胞最終成為細胞膜完整的無核胞質體，這種無核胞質體仍然能夠吞噬病原體，被稱為存活式NET，通常需要5～60 min；（3）源于線粒體DNA的存活式NET，通過這種方式產生的NET，其結構中的DNA來源于中性粒細胞線粒體，而前二者組分中的DNA均來自于細胞核，一般僅需15 min左右。

3 NET與UC

傳統理論認為，中性粒細胞是通過趨化、吞噬和脫顆粒等一系列作用抵御病原微生物的入侵，而NET作為中性粒細胞固有免疫應答的一種特殊形式，通過限制病原微生物活動殺滅病原微生物，在抗微生物感染中發揮了積極作用。早期對NET的研究主要集中在感染性疾病，隨著研究的深入，越來越多的學者發現，NET也參與了其他一些非感染性疾病，如系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、類風濕性關節炎、UC等多種自身免疫性炎癥性疾病的發病過程[12]。然而有別于在感染性疾病中積極的抗感染作用，NET在非感染性疾病中可能發揮了消極作用，反而促進了炎癥的發生和發展。因此，正確認識NET在非感染性疾病中的作用對于闡明疾病的發生機制及對治療靶點的尋求具有重要意義。近年來，NET在UC發病中的研究也逐漸引起了相關人員的關注，并已取得了一些初步結果。

3.1 UC結腸黏膜中存在與NET相關的炎癥反應

2011年，SAVCHENKO等[15]發現在UC患者結腸炎性黏膜中存在NET，并在NET的形成過程中伴隨著炎性蛋白正五聚蛋白（pentraxin，PTX）3的釋放。PTX3是PTX家族的成員之一，屬進化中高度保守的模式識別蛋白家族[16]。根據分子結構和長度的不同，PTX被分為2個組：一組是短PTX，主要包括C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）和血清淀粉樣物質P組分（serum amyloid P-component，SAP），由肝臟產生；另一組為長PTX，PTX3是最早被報道的長PTX，被認為是一種急性期蛋白，在健康人群中含量很低，當受到白細胞介素-8（interleukin 8，IL-8）、TNF-α等炎癥因子刺激時，中性粒細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞、內皮細胞、平滑肌細胞等多種細胞釋放PTX3增加[17]。在UC患者中，PTX3主要來源于中性粒細胞，并且伴隨NET的形成而釋放，反映了腸黏膜炎癥的存在[15]。該研究還進一步分析了NET、PTX3與UC炎癥程度的相關性，采用免疫組織化學技術，按照Matts'分類標準將UC患者炎癥等級分為5級[18]，比較了不同等級患者結腸黏膜PTX3和NET的表達情況，結果發現，隨著炎癥程度的增加，PTX3表達增強，同時伴隨NET形成增加，NET的形成、PTX3的釋放與UC的炎癥程度呈正相關。另外，NET形成還伴隨著促炎因子如S100蛋白質類及天青殺素的釋放，進一步加重了組織的炎癥反應[15]。

隨后，有學者在不同的人群中采用不同的研究方法，均證實了UC中NET的存在。2015年BENNIKE等[19]針對UC成年患者開展了一項蛋白質組學研究，采用液相色譜-質譜聯用儀對10例成年UC患者和10名健康對照者的結腸黏膜組織進行蛋白質分析，結果發現有46種蛋白質在2個組研究對象中存在表達差異，其中11種蛋白質與中性粒細胞和NET相關，包括乳鐵蛋白、中性粒細胞彈性蛋白酶、MPO、S100-A9蛋白、S100-A12蛋白和組織蛋白酶G等。同時，通過DNA染色的方式觀察到了UC患者腸道黏膜組織中的NET。值得一提的是，該項研究收集的UC患者腸道黏膜組織樣本均來自于肉眼所見形態學正常的腸黏膜，表明在UC患者中表觀正常的腸黏膜組織也已存在與NET相關的炎癥反應，推測NET可能在發病的早期即存在，且參與了早期炎癥反應。GOTTLIEB等[20]對6例兒童UC患者和2名兒童健康對照者的結腸黏膜組織進行免疫熒光分析，對NET主要組分的DNA、組蛋白、彈性蛋白酶和MPO作多重熒光染色后進行圖像采集，在所有患者結腸黏膜組織中均觀察到NET，而健康對照者均未表達。DINALLO等[21]的最新研究分別采用蛋白免疫印跡法和免疫熒光技術檢測了23例UC患者和12例結腸癌患者的腸黏膜組織，結果發現UC患者腸黏膜組織中的NET相關蛋白NE、MPO和組蛋白H3等的表達均顯著高于對照組，也證實了NET在UC患者中表達上調，而高表達的NET又能促進UC患者黏膜固有層單個核細胞產生TNF-α和白細胞介素-1β（interleukin 1 beta ，IL-1β），進一步加劇了炎癥狀態。

綜上所述，成人及兒童UC患者的腸道組織中均證實了NET的存在，推測NET可能參與了疾病早期的炎癥反應，并且高表達的NET又能促進炎癥因子的釋放，加劇炎癥反應。

3.2 UC中NET的生成與降解失衡導致其高表達

一般情況下，機體內NET的生成與降解之間維持著動態平衡，如果NET的生成增加或降解減少將導致其高表達，而過量的NET長時間存在于體內會引起組織損傷。

3.2.1 UC患者NET生成增加 在感染性疾病中，NET由多種病原微生物刺激形成[12]，而在自身免疫性疾病等非感染性炎癥性疾病中，IL-8、TNF-α、LPS、IL-17A和抗蛋白酶3型中性粒細胞胞質抗體（proteinase 3-antineutrophil cytoplasmic antibody，PR3-ANCA）[21-24]等多種因子可刺激NET形成。

TNF-α是一種促炎介質，在UC患者中高表達，并且與UC患者腸黏膜炎癥程度呈正相關[25]。DINALLO等[21]不僅證實了UC患者腸黏膜組織中NET高表達，也證明了UC患者體內的中性粒細胞可在TNF-α的刺激下形成NET，而經抗TNF-α治療后的UC患者中性粒細胞產生NET的能力明顯降低。目前，使用生物制劑英夫利昔單抗治療UC是一項較為成熟的方案，而英夫利昔的作用成分正是一種針對TNF-α的特異性抗體，根據DINALLO等[21]的研究結果推測，英夫利昔可能不僅能通過拮抗TNF-α達到治療目的，而且能使TNF-α刺激NET的形成減少，從而阻斷了NET促進黏膜固有層單個核細胞進一步產生TNF-α和IL-1β等這一炎癥的放大過程，達到明顯減輕炎癥反應的治療效果。

IL-8是一種趨化因子，在炎癥部位中性粒細胞的活化和聚集中發揮重要作用[23]，有學者推測IL-8可能參與到了NET的形成過程，這一推測由BRINKMANN等[1]最先證實，即中性粒細胞在IL-8刺激過后能夠形成NET。隨后又有報道顯示，胎盤來源的IL-8可在體外刺激中性粒細胞產生NET[26]，而這一過程可被抗IL-8中和抗體所阻斷，說明IL-8這一炎癥因子在NET形成過程中發揮了積極的作用。在UC中IL-8高表達[27]，從而推測高表達的IL-8促進了UC患者NET的形成，但目前抗IL-8治療的相關研究仍未取得預期的效果。

一項抗中性粒細胞胞質抗體（antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA）相關性血管炎的研究表明[24]，由ANCA介導的中性粒細胞激活可誘導NET形成，NET的形成有賴于中性粒細胞的激活，抗蛋白酶3型中性粒細胞胞質抗體（antiproteinase 3 antineutrophil cytoplasmic antibody，抗-PR3 ANCA）或抗髓過氧化物酶型中性粒細胞胞質抗體（anti-myeloperoxidase antineutrophil cytoplasmic antibody，抗-MPO ANCA）自身抗體可通過結合中性粒細胞表面的PR3或MPO抗原激活中性粒細胞，促進NET的形成。有研究證實，一部分UC患者血清中存在著抗-PR3 ANCA，是臨床輔助診斷炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）的一種血清學標志物[28]，然而抗-PR3 ANCA在UC患者NET的形成中究竟發揮了怎樣的作用，也是值得關注的一個研究節點。

3.2.2 UC患者NET降解受損 DNA酶I（dexoyribonuclease I，DNase I）是機體內降解NET的主要酶，這一酶的缺陷將直接導致NET的降解受損[29]。如在SLE中，NET的生成與降解失衡導致了大量NET的堆積，一方面，MPO、抗菌肽LL-37等NET蛋白質組分出現在細胞外空間并持續存在，刺激宿主免疫系統發生免疫應答，進而產生相應的自身抗體，造成組織損傷；另一方面，SLE患者基因突變導致DNase I活性降低，NET降解受損，使得NET組分抗原持續暴露，加劇了免疫應答，誘導機體持續產生自身抗體，進一步加重了疾病的進展。有研究表明，在IBD患者體內DNase I的活性顯著低于健康對照組，且與英夫利昔單抗的治療效果無關，表明IBD患者DNase I活性降低是一種固有缺陷，可能類似于SLE，由于遺傳突變成為易感個體，直接影響了IBD的發生與發展[30]。由此可以推測，由于IBD患者體內存在DNase I活性缺陷，導致對NET降解能力下降，NET的大量堆積進一步促進患者結腸黏膜單個核細胞釋放多種炎癥因子，加劇了組織的炎癥反應。此外，患者體內的NET組分與相應的多種自身抗體結合，可能是阻礙DNase I對NET降解的原因之一。因此，尋找NET降解的影響因素，阻斷NET堆積引發的嚴重炎癥反應，對UC潛在治療靶點的探索具有積極作用。

4 結語

綜上所述，UC的發病機制可能是遺傳易感個體在外界環境作用下發生了異常免疫反應，產生自身抗體并釋放炎癥因子，而UC患者高表達的IL-8、TNF-α等炎癥因子和自身抗體抗-PR3 ANCA可促進中性粒細胞形成NET。一方面過量的NET組分持續暴露誘導機體免疫系統產生更多的自身抗體加重免疫損傷；另一方面，NET又能刺激腸道黏膜固有層的單個核細胞釋放更多的炎癥因子，加劇機體的炎癥狀態。此外，UC患者體內DNase I活性降低可能影響了體內NET的正常降解，導致NET進一步堆積，促進病情的發展。

目前，NET在UC中的研究均為小樣本，得出的多為表達差異性結果，尚有待更多大樣本研究來驗證并揭示NET在UC發病中的確切作用機制。在接下來的研究中應一方面考慮阻斷使NET形成增加的影響因素，另一方面嘗試修復DNase I活性以期恢復體內正常的NET降解過程，通過體外及動物實驗加以論證，從而為UC治療潛在靶點的探索提供理論支持。