SPINK1、G9a在胃癌中的表達及其對預后的評估價值

王宗艷，段 莎

胃癌是我國常發的消化道惡性腫瘤之一[1]，該疾病早期起病隱匿，且無明顯的臨床癥狀。由于該疾病發生局部浸潤和遠處轉移的時間早，當患者被確診時已錯過最佳治療時間，導致胃癌成為預后差、病死率較高的疾病之一[2-3]。近年來，隨著臨床檢測技術的不斷發展，對腫瘤標志物的檢測已經成為預測腫瘤發生、診斷以及監測或評估患者治療效果的有效參考標準[4]。絲氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型(serine peptidase inhibitor Kazal type 1， SPINK1)基因位于5號染色體[5]，在胰腺癌的研究中顯示，SPINK1的異常高表達與腫瘤的發生和預后密切相關[6]，提示其有可能在胃癌組織中也存在異常高表達現象并參與調控腫瘤的發展及預后。組蛋白甲基化轉移酶G9a能夠將甲基從甲硫氨酸轉移到賴氨酸殘基上[7]，而DNA的甲基化過程往往與腫瘤的發生、發展密切相關，同時有研究指出G9a蛋白在多種腫瘤中存在高表達現象[8]。但目前關于SPINK1和G9a在胃癌中的表達及對胃癌患者預后的研究報道較少，因此本研究以胃癌患者為研究對象，探討胃癌患者癌組織中SPINK1和G9a的表達水平與患者臨床病理分級及對患者預后的影響。現報告如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇2012年1月—2015年6月我院經病理學檢查確診的112例胃癌，男57例，女55例；年齡38～75(55.47±2.18)歲，其中年齡≤60歲62例，年齡>60歲50例；胃癌部位：胃底賁門癌45例，胃體癌33例，胃竇癌34例；腫瘤分期：Ⅰ期29例，Ⅱ期33例，Ⅲ期28例，Ⅳ期22例；分化程度：高分化42例，低分化70例；其中淋巴結發生轉移患者55例；浸潤深度T1期為27例，T2期為31例，T3期為26例，T4期為28例。

1.2納入及排除標準 納入標準：經病理學首次確診為胃癌患者；入院治療前未接受放療、化療、靶向藥物等治療；患者同意接受胃癌手術治療；臨床資料完整，治療依從性良好；身體狀況相對良好，能夠耐受手術治療，預計存活期>1年；患者熟知本課題研究方案自愿參與研究。排除標準：患者存在明顯的腫瘤轉移；合并有其他器官功能異常及嚴重心血管疾病；合并有其他腫瘤；存在用藥過敏、治療不耐受或禁忌證的患者。經醫院倫理委員會通過后展開實施。

1.3材料與方法

1.3.1試劑及儀器：兔抗人SPINK1抗體購自美國Proteintech Group公司，貨號：Ag7931；鼠抗人G9a/EHMT2抗體購自Proteintech Group公司，貨號：66689-1-Ig；圖像采集成像系統(chemiDocTm)及圖像分析系統(Quantity One 1-D分析軟件)購自美國Bio-Rad Laboratories公司。

1.3.2免疫組化：將患者進行病理學診斷時獲得的病理組織由石蠟包埋后連續切片，固定于載玻片上，50℃烘箱中烘1 h后，依次選用二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇及75%乙醇進行水化，蒸餾水洗滌3次，然后置于枸櫞酸鈉溶液中加熱2次，每次8 min，PBS洗滌3次，3% H2O2溶液中浸10 min，PBS洗滌3次后，滴加SPINK1抗體和G9a抗體稀釋液，4℃孵育過夜。PBS洗滌3次后用羊抗兔二抗室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，DAB顯色5 min，蘇木精復染2 min，0.1% HCl分化，藍化，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.3.3數據對比分析：免疫組化結果評估由兩名專業病理人員采用雙盲法進行判定，每張組織切片高倍鏡下隨機選取5個視野區，獨立進行半定量積分的判斷，結果一致則記錄結果；不一致則由2人統一意見或第3位更加權威的醫師確定。顯微鏡下觀察組織細胞，細胞質中出現黃色或棕色顆粒為顯色。評分標準：按染色面積分為染色細胞比例<5%記0分；染色細胞比例5%～30%記1分；染色細胞比例為31%～75%記2分；染色細胞比例>75%記3分。依照染色深淺分為：無染色為0分，微弱染色為1分，中度染色為2分，強染色為3分。最終得分=染色面積得分×染色深淺得分，單種蛋白最終得分>4分定義為陽性高表達；2種蛋白染色最終得分均>4分定義為共高表達患者。

1.3.4隨訪及信息統計：所有患者以門診、住院復查的方式由主治醫師定期隨訪，隨訪內容包括患者治療方案、復查信息、胃部X線氣鋇雙重造影、胃鏡檢查、生存、復發等。時間起始于患者入院治療，隨訪3年，統計患者生存、復發、轉移情況。

2 結果

2.1胃癌組織及癌旁正常組織中SPINK1和G9a的表達 SPINK1和G9a在胃癌組織中的陽性表達率均高于癌旁正常組織，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1和圖1。

表1 112例胃癌組織和癌旁正常組織中SPINK1、G9a的表達情況[例(%)]

注：SPINK1為絲氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型，G9a為組蛋白甲基化轉移酶；與癌旁組織比較，bP<0.01

2.2胃癌組織中SPINK1、G9a表達與臨床病理特征的關系 胃癌組織中SPINK1、G9a表達與浸潤分期、TNM分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)，與患者的年齡、性別、分化程度及腫瘤部位無關(P>0.05)。見表2。

圖1 SPINK1和G9a在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達情況(DAB×40)

SPINK1為絲氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型，G9a為組蛋白甲基化轉移酶

表2 SPINK1、G9a陽性表達與胃癌臨床病理特征的關系[例(%)]

注：SPINK1為絲氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型，G9a為組蛋白甲基化轉移酶；bP<0.01

2.3胃癌組織中SPINK1和G9a表達相關性 胃癌組織中SPINK1和G9a表達情況呈正相關(r=0.831,P<0.05)。見表3。

表3 112例胃癌組織中SPINK1、G9a表達相關性(例)

注：SPINK1為絲氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型，G9a為組蛋白甲基化轉移酶

2.4胃癌組織中SPINK1和G9a高表達與患者生存期的關系 SPINK1和G9a高表達者3年存活率分別低于SPINK1和G9a低表達者，差異有統計學意義(P<0.01)。見表4。

表4 112例胃癌組織SPINK1和G9a高表達與患者生存期的關系(%)

注:SPINK1為絲氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型，G9a為組蛋白甲基化轉移酶；與低表達者比較，bP<0.01

2.5SPINK1與G9a共表達與胃癌預后分析 SPINK1、G9a蛋白共高表達組患者術后中位生存時間、無病生存率、總生存率均低于SPINK1、G9a蛋白共低表達組，差異均有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。見表5、圖2。

3 討論

絲氨酸蛋白酶抑制劑是目前研究發現分布、規模最大的蛋白酶抑制劑家族，已確認的種類超過1500種[9]，其中Kazal1型(SPINK1)最早由胰腺分泌獲得，其主要功能是抑制蛋白酶活性。近年來隨著對腫瘤標志物的研究發現，SPINK1蛋白結構與表皮生長因子(EGF)類似[6]，能夠通過MAPK信號通路，磷酸化EGF受體蛋白刺激細胞的生長，在腫瘤的發生和發展過程中發揮自分泌生長因子的作用[10]。同時腫瘤會引起患者血液中SPINK1水平升高，在對癌癥患者的同種器官組織研究發現，在正常組織中SPINK1表達水平較低，但在腫瘤組織中存在明顯的高表達現象[11]，提示SPINK1蛋白的表達水平可以作為預測腫瘤發生的標志物。

組蛋白轉移酶能夠以s-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，進行甲基轉移[12]，其中G9a是指組蛋白第9位甲基轉移酶[13]，由于G9a的甲基化參與染色質的形成、DNA修飾及基因的轉錄與沉默，而腫瘤的發生被認為是遺傳基因的改變引起的一類疾病，大量臨床研究顯示組蛋白進行的表觀遺傳異常修飾，與腫瘤的發生、發展密切相關[14]。在乳腺癌、肺癌等多種腫瘤中均能發現大量表觀遺傳修飾異常細胞的存在，進一步分析發現均存在明顯的G9a高表達現象[15-16]，表明G9a可能在腫瘤發生及轉移過程發揮積極作用。

表5 SPINK1與G9a共表達與胃癌預后分析

注：SPINK1為絲氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型，G9a為組蛋白甲基化轉移酶；與SPINK1、G9a蛋白共低表達比較，aP<0.01，bP<0.01

圖2 SPINK1與G9a共表達水平與患者生存曲線分析

SPINK1為絲氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型，G9a為組蛋白甲基化轉移酶

本研究結果顯示，SPINK1、G9a在腫瘤組織中的陽性表達率顯著高于癌旁正常組織，與Zhang等[17]、李厚雷等[18]研究結果一致。本研究結果還顯示，胃癌組織中SPINK1和G9a的表達水平與腫瘤浸潤、TNM分期、淋巴結轉移密切相關，而與患者年齡、性別、分化程度、腫瘤部位無關。有研究指出SPINK1可能通過作用表皮生長因子轉導通路，影響腫瘤細胞的增殖和侵襲能力[19]，而沉默腫瘤細胞G9a的表達能夠顯著降低腫瘤細胞的侵襲遷移能力[20]，提示檢測患者腫瘤組織中SPINK1、G9a的表達水平可反映疾病發展程度。本研究對兩種蛋白的表達相關性分析發現，SPINK1與G9a表達存在顯著的共表達現象，SPINK1與G9a高表達患者的3年存活率均顯著低于共低表達患者。同時對SPINK1與G9a共高表達3年的預后情況分析發現，共高表達患者的中位生存時間、無病生存率、總生存率均低于共低表達患者，其原因可能是由于兩種蛋白的高表達水平往往預示著腫瘤細胞處于增殖旺盛期，患者存在較高風險的腫瘤轉移，導致患者治療難度大，不利于患者的預后和長期生存[21-22]。

綜上所述，胃癌組織中SPINK1、G9a的高水平表達與胃癌發生、發展及預后密切相關。有研究指出腫瘤患者的血液和尿液中與正常人相比也會存在SPINK1與G9a高表達現象，與本研究免疫組化染色相比，樣本獲取及檢測更為簡潔，因此在后續的研究中，將主要探究患者血清或其他體液中SPINK1、G9a的表達水平與胃癌患者疾病發展及預后的關系。