M蛋白有效抗腫瘤片段的篩選

魏繼芳，白靜，杜浩，楊俊峰，陳浩，杜娟

（延安大學醫學院，陜西 延安 716000）

0 引言

M蛋白是全長由229個氨基酸殘基構成的VSV基質蛋白。在抗腫瘤過程中，M蛋白不僅可以通過RaeI/Nup98抑制細胞mRNA從細胞核向細胞質的轉運，改變剪切因子hnRNP H在細胞中的定位，還可以通過激活Caspase直接誘導細胞凋亡[1-2]。目前，有報道稱野生型M蛋白的編碼產物有三種[3]：M1，即全長M蛋白；M2，即僅含全長M蛋白第32位到299位氨基酸殘基的片段；M3，即含全長M蛋白第51位到299位氨基酸殘基的段片段M蛋白。這三種M蛋白在細胞內定位雖然存在差異但都保留了誘導腫瘤細胞發生凋亡功能。三種野生型M蛋白在誘導腫瘤細胞凋亡中的作用提示：M蛋白可能僅通過其部分結構域發揮抗腫瘤作用。而有關M蛋白結構域功能的報道：M蛋白通過其LDX模體（aa 123-125）參與VSV病毒-宿主間的相互作用和VSV病毒的復制過程，通過其Late-domain 模體（包括PPPY結構域（aa 24-27）和PSAP結構域（aa 37-40））參與細胞毒性和VSV病毒的出芽，Late-domain模體缺失的M蛋白不能使VSV病毒分子脫離宿主細胞膜而釋放[3,4]，則證實了以上推測。因此，本文從M蛋白結構出發，利用基因體外操作技術剔除M蛋白的非抗腫瘤序列，找出M蛋白的關鍵抗腫瘤結構域，為可用于腫瘤治療的M蛋白瘦身。

1 實驗方法

1.1 重組質粒的構建。以pVAX1-MP（M蛋白真核表達載體）為模板，擴增包含M蛋白不同區域的片段，與真核表達載體pEGFP-C1連接，構建成不同片段M蛋白的融合表達質粒pEGFP-C1-M1（即全長M蛋白，含有299個氨基酸殘基），pEGFP-C1-M2（含M蛋白第32-299位的氨基酸殘基），pEGFP-C1-M3（含M蛋白第51-299位的氨基酸殘基），pEGFP-C1-M 4(含M蛋白第75-299位的氨基酸殘基），pEGFP-C1-M5（含M蛋白第120-299位的氨基酸殘基）和pEGFP-C1-M6（含M蛋白第200-299位的氨基酸殘基）。送于基因檢測公司進行DNA測序，測序正確的質粒用于后續實驗。

1.2 質粒的提取與細胞培養。將測序正確的重組載體經轉化、擴增后進行去內毒素大提。離心去除雜質后用于真核細胞轉染。將人胃癌SGC-7901細胞培養與含10%胎牛血清的1640培養基中，觀察細胞形態，用脂質體轉染法將各表達載體轉染入細胞，熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

1.3 細胞增殖檢測。脂質體轉染法將各重組質粒轉染入細胞，按說明書用CCK-8細胞增殖檢測試劑盒對細胞增殖情況進行檢測。

1.4 實驗數據的收集。拍攝細胞圖片，收集質粒電泳圖和處理細胞增殖檢測數據。

2 實驗結果

2.1 圖1為測序正確的重組質粒與對照質粒電泳圖。

從左向右，各泳道分別為DNA Marker，pEGFPC1-M6，pEGFP-C1-M5，pEGFP-C1-M4，pEGFP-C1-M3，pEGFP-C1-M2，pEGFP-C1-M1，pEGFP-C1。

2.2 結果如圖2所示。

圖2 M蛋白不同區域表達載體在細胞內的表達，從左至右：上排pEGFP-C1，中排：pEGFP-C1-M1，pEGFPC1-M2，pEGFP-C1-M3；下排：pEGFP-C1-M4，pEGFP-C1-M5，pEGFP-C1-M6

2.3 如圖3所示。

圖3 CCK-8檢測不同M蛋白片段對SGC-7901細胞增殖的影響

3 討論

本研究構建了不同M蛋白截短體的真核表達載體；并用CCK-8檢測測定了不同M蛋白截短體的抗腫瘤活性，但還有很多不足。首先，研究僅在胃癌細胞的一個細胞株中對M蛋白及其不同片段的抗腫瘤活性進行了探究，未在其它胃癌細胞、其它組織來源細胞和實驗動物體內進行實驗，為此，研究結果的適用范圍較為局限。其次，研究未對M蛋白及其有效抗腫瘤片段的作用機制進行探究，M蛋白及其有效抗腫瘤片段的作用機制還不清楚[5-7]。

研究通過體外實驗在腫瘤細胞中對M蛋白的有效抗腫瘤片段進行來篩選，然而其體內抗腫瘤作用的效果和具體抗腫瘤作用的機制還不清楚。為此，研究后期將會通過動物模型進一步探究M蛋白的抗腫瘤作用，另外，研究也會進一步對M蛋白有效作用片段的抗腫瘤作用機制進行進一步的探討[8-10]。