初探BRAFV600E免疫組化在甲狀腺乳頭狀癌中的應用

羅昊，劉艷麗，刁國慶，吳敏，劉東，劉鑫

（北京市昌平區醫院 病理科，北京 102200）

0 引言

甲狀腺癌是最常見的內分泌腫瘤，據北京市2015年癌癥播報數據顯示甲狀腺癌已上升為女性癌癥發病率的第三順位。近年研究發現甲狀腺乳頭狀癌與BRAF基因突變有密切關系，尤其是BRAF第600位纈氨酸（V）向谷氨酸（E）的突變，研究數據表明甲狀腺乳頭狀癌中BRAFV600E突變率高達29%-83%[1-3]，被認為是甲狀腺乳頭狀癌不良預后因素。但目前的主流研究BRAFV600E突變的方法主要為DNA測序以及基于PCR的各種分子生物學方法等，這些分子生物學檢測需要專業的操作人員而且實驗條件要求嚴格，實驗成本高和周期長，價格較高，病人花費較多，不利于 BRAFV600E突變的檢測和應用。本文擬通過免疫組化法檢測BRAFV600E突變蛋白PTC中的表達分析，探討免疫組化法檢測BrafV600E突變的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料。收集2016年8月至2018年8月昌平區醫院病理科接收60例甲狀腺病變手術切除標本。其中PTC組49例，男女比例1:3，患者年齡28-76歲；其中微小甲狀腺乳頭狀癌（直徑＜1.0 cm）35例；10例有區域淋巴結清掃病例中僅3例有淋巴結轉移；PTC組中經典型PTC47例，濾泡亞型2例（包括其中一例為包裹型濾泡亞型）。其他良性病變共10例。PTC組中1例經PCR檢測證實BRAFV600E陽性病例作為陽性對照，另取1例濾泡癌，1例皮膚組織作為陰性對照。

1.2 實驗方法。所有染色組織選自非冰凍組織蠟塊，切片厚度4 μm，經烤箱70度烤30 min。其后使用羅氏診斷BRAF V600E（VE1）抗體檢測試劑盒（英文名：VENTANA anti-BRAF V600E（VE1） Mouse Monoclonal Primary Antibody，購于北京巴瑞試劑公司），并按照試劑盒說明書操作，在本塔納標準全自動染色平臺上進行免疫組織化學染色。染色結果由兩位高級職稱醫師觀察評判，當腫瘤細胞漿的出現染色被認為是正確的染色部位；但腫瘤細胞僅有散在、微弱陽性判讀為BRAFV600E突變蛋白陰性；當大于85%的腫瘤細胞漿出現中等強度以上染色則判讀為BRAFV600E突變蛋白陽性[4]。

1.3 統計學分析。本文中所有數據SSPS 21.0軟件做χ2檢驗分析，當P＜0.05為具有統計學顯著意義。

2 結果

2.1 BRAFV600E免疫組化結果

2.1.1 PTC與非癌組織的結果對比：49例甲狀腺乳頭狀癌組中其中1例由于腫瘤組織太少，免疫組化切片上已無腫瘤組織，因此從PTC組剔除，PTC組最終剩余48例病例數進行統計研究。48例PTC組中有38例表達BRAFV600E突變蛋白陽性，總陽性表達率為（38/48）79.1%而甲狀腺非腫瘤組BrafV600E突變蛋白陽性表達率為0，（χ2=19.59，P＜0.01）兩組差別有顯著統計學意義。

2.1.2 相關臨床特征分組之間的差別：將48例PTC按照性別、年齡（＞45，≤45）、腫瘤大小（≥1 cm，小于1 cm）、腫瘤有無包膜侵犯等分組分析BrafV600E突變蛋白表達情況，結果顯示各組之間差別均無統計學意義，見表1。另由于本組數據中有淋巴結轉移較少未做統計，3例有轉移癌淋巴結病例中兩例BRAFV600E陽性，1例由于組織飛片無法判斷。

3 討論

隨著BRAFV600E突變蛋白單抗VE1 的誕生，免疫組化檢測BRAFV600E突變也應運而生，雖然Dan Chen等的研究中發現2例IHC陽性而PCR陰性病例，認為IHC可能存在少量假陽性[5]，但多項研究表明BRAF V600E免疫組化在組織中檢測的結果與PCR等檢測方法結果相比較都有較好的一致性[6-7]。本研究組中48例甲狀腺乳頭狀癌組中有38例BRAF V600E陽性，總體的陽性率79.2%。結果與Jung-Soo等一項包含不同國家11篇文章的1141病例的meta分析中得出甲狀腺乳頭狀癌中BRAF V600E免疫組化檢測的總體陽性率79.1%[6]相符，因此可見免疫組化法有較高的可靠性和穩定的。

表1 兩組患者相關臨床特征對比

當前關于BRAF V600E突變與甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理關系，研究結論仍不一致，部分研究認為BRAFV600E突變與患者年齡，腫瘤大小，生長方式，腫瘤分型，遠處轉移等有關[8-9]而有些研究認為BRAF V600E突變僅僅與區域淋巴結轉移有關，與其他臨床信息均無關系[4]本研究中也得到類似結果。筆者推測多項研究的不一致性可能由于樣本量和人群以及研究方法之間的差異所致，但同時可能提示BRAFV600E突變并非與某項臨床病理信息存在確定相關性，而只是腫瘤發生相關的一種分子機制。同時，我們已知甲狀腺乳頭狀癌生物學性質相對溫和，雖然其區域淋巴結轉移率可達20%-60%[10]，尤其是經典的甲狀腺乳頭狀癌病例中，但是僅有10%-15%的病例會表現為侵襲發展的行為，與當前甲狀腺乳頭狀癌中BRAFV600E高達29%-83%的突變率存在一定差異。因此推測BRAFV600E突變可能是腫瘤發生相關的一種分子機制，是影響甲狀腺乳頭狀癌預后的一個因素，但并非唯一的關鍵因素。關于BRAFV600E突變對于甲狀腺乳頭狀癌的更大的意義可能在于其相關分子藥物靶向治療，而非不良預后的預測上。因此改用成本較低、易操作的免疫組化方法有助于BRAFV600E突變檢測推廣，從而使更多患者受益。

當然，由于當前免疫組化的方法運用并不廣泛，對BRAFV600E突變的免疫組化結果仍缺乏統一的判讀標準[11]。一些研究者認為腫瘤細胞漿中出現中-強度的染色即確定為陽性[5-9]，未對腫瘤細胞陽性的數量并未提出要求；而Fisher等認為只有＞10%腫瘤細胞漿內出現中度-強度的陽性才能判讀為陽性[12]。其他一些學者則認為彌漫＞85%腫瘤細胞漿內出現明確染色可以判讀為陽性[4]，因此建立統一的標準的判讀標準，是推廣BRAFV600E免疫組化作為初篩方法的首要問題。

綜上所述，BRAFV600E免疫組化以其較高的可靠性和簡便快捷，易操作，花費低等優點可作為初步鑒別診斷手段以便廣泛運用于甲狀腺乳頭狀癌組織及細胞學診斷中。其次建立規范的BRAFV600E免疫組化的結果判讀標準，研究和確立類似于乳腺、胃的關于HER-2檢測與治療相關性的系列關系，可能是未來研究BRAFV600E突變在甲狀腺乳頭狀癌患者個性化治療中的作用的關鍵問題。