微膠囊疫苗的研究進展

周 游，馬文澳，趙 位，喻 東，楊 威，姚學萍，羅 燕

（四川農業大學動物醫學院 611130）

微膠囊技術（Microcapsule technology）是指用一種或多種高分子材料制成壁殼包裹某種物質，制成微小粒子的一門技術。 微膠囊在常態下通常為固態的球形結構，分為外殼和內芯，組成外殼的物質稱為壁材，組成內芯的物質稱為芯材[1]。 微膠囊可以隔絕外界不良環境（過高的pH、溫度、消化酶），改變物體內在性質（屏蔽氣味、毒性、顏色），控制物質的釋放時間等作用。 它已廣泛應用于生物醫藥、化工、食品、農業等領域。 微膠囊技術作為疫苗生產的一種方法，具有穩定性、可控性、混合性等多種優點，可以廣泛應用于口服、鼻用、或腸外給藥[3]，目前已成為新型疫苗技術的研究熱點[4]。 本文綜述了疫苗微膠囊化的壁材選擇，疫苗微膠囊化的主要方法，微膠囊口服疫苗的優點及效果評價的指標，為疫苗微膠囊化的深入研究提供參考。

1 壁材

微膠囊的壁材主要分為三種：天然高分子材料、半合成高分子材料、全合成高分子材料。 天然高分子材料通常有碳水化合物（如殼聚糖、果膠、海藻酸鈉等）、蛋白質（如明膠、白蛋白、大豆蛋白等）、脂類（如油脂、硬脂酸、卵磷脂等）。 半合成高分子材料主要是各類纖維素衍生物（如甲基纖維素、乙基纖維素、一羧甲基纖維素等）、變性淀粉、氫化油脂等。 全合成高分子材料主要包括不可降解材料與可降解材料， 其中可降解吸收材料 （聚氨基酸、聚甲基丙烯酸甲酯等）在食品、疫苗等領域得到了廣泛利用。

2 壁材的選擇

壁材的選擇與微膠囊的性質息息相關，決定了微膠囊的機械強度、緩釋性、降解性等[5]。 如天然高分子材料具有無毒成膜性好的特點，常常作為蛋白質、微生物、多糖類的微膠囊化。 因此，在選擇不同種類的高分子材料作為壁材時，應考慮以下幾點：壁材本身的性質（如滲透性、穩定性、機械強度等）；壁材與芯材的生物相容性；壁材對制備方法的影響；壁材為無毒，可降解的高分子材料；壁材的來源廣泛且價格低廉。

但在實際生產中，一種高分子材料很難滿足以上條件，因此往往使用多種材料聯合制成壁材包裹抗原，如海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊、聚丙交酯-乙醇酰胺微膠囊[7]等。

3 疫苗微膠囊化的方法

由于芯材、壁材的不同選擇，所需的成囊條件也不盡相同，制備工藝較為繁多，但大致分為物理、物理化學、化學三大類。

3.1 物理法

3.1.1 噴霧干燥法 將芯材分散至壁材溶液，經噴霧器霧化成小液滴后進行熱交換使壁材溶劑蒸發凝固成囊。 用噴霧干燥法制微膠囊時，受壁材的選擇、芯壁比、乳化工藝、噴霧方式、進風溫度等多種因素的影響， 制得的微膠囊粒徑一般為10～300μm，甚至更大。 產品多為球形的單個顆粒或不規則的聚集體[8]。

3.1.2 超臨界流體法 超臨界流體法所用工藝與噴霧干燥法相近，只是超臨界流體代替了噴霧干燥工藝中所用的水，常用超臨界CO2代替。 一般采用兩種方法形成微粒：超臨界溶液的快速膨脹；超臨界反溶劑結晶路線[9]。 該方法相比于噴霧干燥法，形成的包囊更為均一，芯材釋放時間更長。

3.2 化學法

3.2.1 銳孔-凝固浴法 以可溶聚合物為壁材，并在其溶液中加入活性物質， 將分散液通過銳孔裝置加在另一液體中凝固得到微膠囊。 該方法固化反應進行非常快，需在向含有芯材的聚合物溶液加入固化劑之前預先成球形。 且因銳孔大小的不同，粒徑往往有較大差異，通常為毫米級微膠囊[10]。

3.2.2 界面聚合法 將芯材乳化或分散在一個溶有壁材的連續相中，然后單體經聚合反應在芯材表面形成微膠囊。 該方法主要受攪拌、雜質、表面活性劑、溫度等因素的影響。

3.3 物理化學法

3.3.1 單凝聚法 芯材分散至以一種高分子材料作為壁材的水溶液中，加入凝聚劑降低壁材與水的溶解度，壁材凝聚沉淀成囊。

3.3.2 復合凝聚法 用兩種或兩種以上帶有相反電荷的高分子材料作壁材，將芯材分散在壁材溶液中，在適當條件下，相反電荷的高分子材料發生靜電作用凝聚成囊。 pH 值和濃度的大小主要影響成囊的效果，且當材料的相反電荷相等時，才能達到最大產率。

3.3.3 復相乳液法 將芯材分散至壁材溶液中， 后除去連續相中的溶劑成囊。 該方法適用于活性材料的微膠囊化，且包埋過程中不會引起活性成分的變性。 微膠囊粒徑的大小主要受初始液體的粘度、攪拌速率和溫度等因素的影響。

4 疫苗微膠囊化的優點

4.1 傳統獸用疫苗的特點

目前的傳統獸用疫苗主要分為滅活疫苗和減毒活疫苗[11]。獸用疫苗在制作工藝、使用方法、使用途徑等方面存在多種問題[12]。如：（1）注射滅活疫苗或死疫苗的免疫期短，需多次接種免疫，應激反應強烈。 尤其是一些水產動物接種時，傷口不易長好，容易造成二次感染[13]。 （2）滅活疫苗主要引發體液免疫，難以誘導機體產生細胞免疫。（3）注射或口服活疫苗的抗原易被體內的不良環境破壞，降低其活性，且缺乏緩釋功能，需多次接種才能達到預想療效，導致費用增高，免疫效率降低等問題。（4）活疫苗在保存、運輸、使用中都需冷藏保存，容易因保存條件不當導致免疫失效。 （5）活疫苗注射后，由于患者的自身傳播性質可能導致減毒苗的毒性恢復或增加，引起機體炎癥反應[14]。

4.2 疫苗微膠囊化的特點

4.2.1 穩定性

將疫苗制成微膠囊后，由于外界壁材的保護，可以避免不良環境（光照、pH、酶等）對疫苗品質的破壞[15]。

4.2.2 緩釋性

在機體或外環境中，微膠囊包裹的抗原將持續地緩沖式釋放，使機體產生長久高效的抗體。這種性質與微膠囊的孔徑大小有關，通過調節孔徑大小，可以人為控制抗原的釋放速度或釋放地點。 應用不同壁材的物理、化學特性，可以人為地使微膠囊在一定的環境刺激下的三維構象發生改變，從而改變孔徑大小，控制釋放速度，以達到緩釋控釋的目的。Chu[16]等人制得的對Ba2+敏感的微膠囊在溶液中的釋放速度快，但在BaCl2條件下，芯材的釋放速度明顯下降。 除此之外， 還存在一些對溫度、pH、 電場、Ca2+等刺激產生反應的微膠囊。這些環境刺激反應微膠囊可以在一定條件下控制釋放或減緩釋放芯材， 提高機體對該物質的吸收利用。

4.2.3 粘附性

生物粘附給藥系統 (bioadhesive drug delivery system,BDDS）指具有粘附性的高分子材料作為藥物載體與胃腸道粘膜液層/上皮細胞相互作用，延長藥物滯留時間，進入接觸處的黏膜上皮進入循環系統。殼聚糖作為一種陽離子生物聚合物，可與帶負電的聚合物結合， 靶向性地給藥到胃腸道上部[17]。Mukhopadhyay P 等人發現， 微球及納米制劑可以顯著延長在胃腸道的滯留時間，延長藥物作用時間，提高生物利用率[18]。

4.2.4 靶向性

某些高分子材料因有獨特的理化性質， 能夠抵抗不適環境，直到到達給藥部位才會緩釋。 如海藻酸鈉[19]具有良好的抗酸性，故常用于胃腸道的給藥。 除此之外，Zebli[20]等人構建了磁性靶向微膠囊，通過在局部創建磁場梯度，令帶有磁性的微粒被大量吸附在該區域，以提高細胞對膠囊的吸收。

4.2.5 免疫反應

微膠囊口服疫苗主要在腸道降解和淋巴組織的低吸收。 當微膠囊疫苗的粒徑≤10μm 時，易向腸集合淋巴結（PP）遷移，并被特殊腸上皮細胞-M 細胞攝取轉運至深層腸集合淋巴結；粒徑≤5μm 時，微膠囊口服疫苗易被巨噬細胞吞噬，抗原被轉移至系統淋巴組織，誘導機體產生系統免疫反應；粒徑＞5μm 時，抗原會滯留于富含B 細胞的腸集合淋巴結，使B 細胞致敏，從而引起黏膜分泌sIgA[21]。

4.2.6 降低聯苗的拮抗作用

傳統獸用疫苗聯合接種時，不同種苗可能會在機體內產生拮抗作用，降低免疫效應。用微膠囊技術將兩種或兩種以上的疫苗分別用不同壁材處理后混合制成聯苗，由于壁材選擇的不同，打開釋放抗原的時間和速度也不相同， 可以大大降低不同疫苗的拮抗作用，增強機體的免疫反應[22]。

5 疫苗微膠囊化效果的評價指標

5.1 Zeta 電位

Zeta 電位指連續相與附著在分散粒子上的流體穩定層之間的電勢差，是表征膠體分散系穩定性的重要指標[23]。 Freitas 等[24]利用Zeta 電位探究了納米脂質體在光與溫度下的穩定性。 在外電場的作用下，微膠囊顆粒因表面電荷的不同，會向極性相反的電極移動， 通過顯微鏡觀察粒子的遷移速度即可得到Zeta 電位[25]。

5.2 包埋率

包埋率指芯材被包埋后與微膠囊產品中總的芯材含量之比。 在微膠囊化過程中，部分芯材未能被完全包埋，留于表面，容易被體內的不良環境破壞其活性。 包埋率是衡量微膠囊效率的重要指標，受壁材選擇、制作工藝等多種因素影響[26]。

5.3 保留率

在一定條件下貯存一段時間后，微膠囊所包裹芯材含量與初始微膠囊中芯材的含量之比稱為芯材保留率。 它反映了微膠囊對芯材的保護作用，是評價微膠囊質量的重要指標。 在微膠囊口服疫苗的應用中， 表現疫苗經過胃液最終到達腸道被吸收并產生作用的含量高低。 通常采用體外試驗模擬體內環境，測定抗原釋放模型及緩釋能力。

5.4 粒徑大小

由于制作方法、壁材選擇的不同，微膠囊的大小與結構差異往往較大。 球形微膠囊的直徑就是粒徑，非球形微膠囊的粒徑即為等效球體的直徑表示。 大量實驗表明，粒徑≥10μm 的微膠囊疫苗誘導機體產生的sIgA 抗體滴度明顯小于粒徑＜10μm 的微膠囊疫苗。 而王繼鱗等人用聚乳酸/聚乙醇酸共聚微球作為破傷風疫苗載體，發現不同粒徑微球混合后免疫大鼠，能夠進一步提高免疫效應[27]。

5.5 緩釋速度

一般認為芯材從微膠囊向外釋放的過程包括3 個步驟，第一步是水進入微膠囊，第二部是芯材溶于水中，第三部是芯材從高濃度水溶液透過囊壁擴散到低濃度水相中。 在此過程中，有多種因素（囊壁厚度、孔徑大小、芯材性質等）決定了芯材釋放到外界的速度。 在腸溶性口服疫苗中， 通過人工控制疫苗的釋放速率，可以長期穩定地刺激機體產生高效抗體[28]。但也有研究表明，生物可降解微球進入體內后，高酸性微環境快速形成，將聚酯微球內pH 值降低至3 以下導致壁殼加速腐蝕， 令抗原提前釋放，降低緩釋效率[29]。

5.6 膨脹指數

膨脹指數指微膠囊吸收水分的參數，其導致孔道形成并加速芯材移出膠囊，預先判斷了微膠囊的藥物釋放特性[30]。 有研究表明，口服給藥后，被困在聚合物系統中的蛋白質的水合作用可能會延長釋放時間[31]。

5.7 黏附性能

微膠囊由于壁材選擇的不同，往往呈現帶電性。 因此微膠囊在機體的吸收過程中， 可以與黏膜上帶電的蛋白質產生靜電作用，粘附于黏膜表面，從而增加單位面積內的微膠囊濃度，延長藥物的作用時間。 Dhawan 等人發現帶正電的殼聚糖可以與腸黏膜表面帶負電的糖蛋白相互吸引產生分子引力， 這種結合過程主要是黏膜黏液層與黏附聚合物相互作用的結果， 取決于殼聚糖制作工藝的不同[32]。

6 結語

微膠囊疫苗相比于傳統獸用疫苗擁有多種優點，不僅延長了免疫的時間，而且增強了免疫的效果，有望在未來成為獸用疫苗的主要制作方法。 但微膠囊疫苗的免疫效果受壁材與芯材相容性、制作工藝的影響，且疫苗在動物消化道分解、釋放、吸收的機制也有待深入研究。 隨著微膠囊技術逐步地發展與完善，微膠囊疫苗將擁有更加廣闊的前景。