仔豬大腸桿菌性腹瀉病的病原分離鑒定

徐海生

（赤峰市動物衛生監督所 024000）

大腸桿菌（Escherichia coli）又稱大腸埃希氏菌，是食品衛生安全評價中重要的指標菌，普遍存在于人和動物腸道內，對人和動物具有致病性，常引起嚴重的敗血癥和腹瀉[1]。 仔豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的仔豬消化道傳染病， 是一種條件性致病菌，在養豬生產中多因陰冷潮濕、保溫不好、溫差過大、轉群換料導致仔豬發病和死亡，發病率和死亡率均較高。 在養豬生產中，由于抗生素的不規范和盲目使用，導致細菌耐藥譜不斷擴大［2］，給豬大腸桿菌病的治療和控制帶來困難，同時對人類健康及公共衛生安全構成嚴重威脅[3]。 為了解赤峰地區仔豬大腸桿菌流行情況， 本研究從赤峰地區3 個規模化豬場采集了發生腹瀉的仔豬腸道內容物，對本地區流行的血清型進行了分析，旨在為該地區仔豬大腸桿菌病的預防及細菌耐藥性研究提供參考。

1 實驗材料及方法

1.1 材料

1.1.1 病料

赤峰市3 個規模化豬場收集仔豬腹瀉肛門拭子，共99 個樣本。

1.1.2 主要試劑及培養基

單價血清：“O”抗原單價血清（批號：20170201），產自寧波天潤生物藥業有限公司，革蘭氏染色液，麥康凱瓊脂，營養瓊脂，營養肉湯，三糖鐵培養基（TSI），糖發酵管，MR 試劑，VP 試劑，靛基質試劑。

1.1.2 實驗動物

53 只清潔級BALB/c 小鼠（體重18～23g，雌雄各半）。購買自北京中醫藥大學實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離培養

將采集的99 只肛門拭子棉簽放入2mL 無菌生理鹽水中浸泡5min，取0.2mL 含有病原的生理鹽水接種在5mL 營養肉湯培養基中，37℃培養24h，觀察試管內菌液特征。 用接種環挑取渾濁菌液，接種在麥康凱瓊脂平板上，37℃培養24～48h［4］，觀察菌落特征。

1.2.2 分離菌染色鏡檢

觀察麥康凱瓊脂平板培養基菌落， 紅色菌落為疑似大腸桿菌，用接種環挑取疑似菌落進行涂片，采用革蘭氏染色，鏡檢觀察菌體特征。 同時對疑似菌落進行純培養。

1.2.3 生化實驗

利用糖發酵試驗（包括：葡萄糖C6H12O6、乳糖C12H22O11、麥芽糖C12H22O11·H2O 、鼠李糖C6H12O5、木糖C5H10O5、蔗糖C12H22O11、甘露醇C6H14O6、果糖C6H12O5、山梨糖醇C6H14O6和衛矛醇C6H14O6發酵試驗）、尿素酶試驗、櫞酸鹽利用試驗、甲基紅（MR）試驗、VP 試驗和吲哚試驗對純培養物進行鑒定和篩選，并記錄相應的結果。

1.2.4 血清型鑒定

通過分離培養、染色鏡檢、生化試驗后初步確診的大腸埃希菌接種在普通營養瓊脂斜面進行純培養， 培養后用5g/L 的石炭酸生理鹽水將菌苔洗下，制成菌懸液，菌懸液在121℃的環境高壓處理2h，意在破壞大腸埃希菌的“K”抗原，待菌液冷卻后，挑取一鉑耳環菌液與已稀釋5 倍的大腸埃希菌O 抗原單價血清在玻板上混勻，同時菌懸液與生理鹽水混合物作對照，觀察有無自凝集現象，若30s 內出現明顯凝集者為陽性［5］。

1.2.5 小鼠致病性試驗

將鑒定為大腸桿菌的細菌菌液用滅菌生理鹽水稀釋至2×106CFU/mL 后接種到營養液中培養24～48h，以供攻毒用。 試驗組選擇48 只清潔級BALB/c 小鼠每只分別腹腔內注射0.2mL 菌液；對照組選擇5 只清潔級BALB/c 小鼠，每只分別在腹腔內注射0.2mL 的生理鹽水，試驗組和對照組接種后，觀察72h，隨時記錄小鼠的變化情況。 小鼠死亡后立即對胸腹腔內實質性器官進行細菌學檢查。

2 結果及分析

2.1 分離菌在鑒別培養基上的菌落特性

將收集到的病原菌接種到麥康凱瓊脂平板上，99 份供試樣品中有60 份在麥康凱瓊脂平板上出現圓形、中等大小的紅色菌落，表明這些菌落發酵乳糖，初步認定為疑似大腸埃希菌菌落。其余39 份顯示為其他菌落或不存在典型菌落形成。

2.2 分離菌的染色鏡檢

取麥康凱培養基上紅色菌落進行革蘭氏染色，在油鏡下觀察到革蘭氏陰性、兩端鈍圓的短桿菌（圖1）。疑似60 株菌均為大腸埃希菌。

圖1 分離菌的染色鏡檢（革蘭氏染色）

2.3 生化實驗

對60 株疑似大腸桿菌純培養后進行生化試驗， 結果表明（表1），5 株菌株不符合大腸桿菌生化特性，其余的55 株分離菌生化試驗的特點明顯：能分解葡萄糖C6H12O6、乳糖C12H22O11、麥芽糖C12H22O11·H2O、鼠李糖C6H12O5、木糖C5H10O5、蔗糖C12H22O11、甘 露 醇C6H14O6、 果 糖C6H12O5、 山 梨 糖 醇C6H14O6和 衛 矛 醇C6H14O6，尿素酶試驗陰性，枸櫞酸鹽利用率試驗陰性，MR 試驗陽性，V-P 試驗陰性，吲哚試驗陽性。 初步得出分離的60 株細菌有55 株為大腸桿菌。

2.4 血清型鑒定

對55 株大腸埃希菌采用O 抗原單價血清進行血清型鑒定。結果表明（表2），48 株大腸埃希菌血清型實驗陽性，分布在7個血清型中，其中優勢血清型為O8（21 株），其他血清型包括O20（3 株），O45（3 株），O60（5 株），O139（5 株），O141（3 株），O149（8 株）。

表1 分離菌生化試驗結果

表2 大腸埃希菌血清型鑒定結果

2.5 小鼠致病性試驗

對實驗小鼠的發病情況和臨床癥狀進行觀察和統計得出48 株分離細菌可引起小鼠出現活動性降低、采食量減少、全身間歇性顫抖等癥狀。 在攻毒48h 內有24 株分離菌使小鼠死亡，發現血清型為O8的有18 株，O141的有3 株，O149的有3 株。 對死亡的小鼠進行解剖， 分別取其心臟血在麥康凱瓊脂平板上劃線分離培養，37℃培養24h，均得到了疑似大腸埃希菌，挑取疑似菌落進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察到革蘭氏陰性的、兩端鈍圓的短小桿菌。而對照組的5 只小鼠全部健康。分離株對小鼠的致病性試驗結果見表3。

3 討論

表3 各血清型大腸埃希菌致病性試驗結果

本實驗的方法是用腹瀉仔豬的肛門棉拭子進行取樣， 對大腸桿菌進行分離和鑒定，為防止因細菌含量低而造成檢測困難，實驗先進行營養肉湯的前增菌，再進行分離劃線，這樣保證接種平板時獲得較好地分離效果。 生化反應是鑒定大腸桿菌的經典方法，99 份樣品中有48 分鑒定為大腸桿菌， 進一步通過血清學鑒定血型后， 培養菌懸液接種小鼠， 試驗組小鼠出現活動性降低、采食量減少、全身間歇性顫抖等臨床癥狀，在攻毒48h 內有24 株分離菌使小鼠死亡，對照組小鼠運動和飲食均正常，細菌學檢驗結果顯示，在麥康凱培養基上，分離于豬和小鼠的菌株均呈玫紅色圓形菌落； 革蘭氏染色后菌體形態為兩端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌。 綜合上述結果，最終確定松山區仔豬腹瀉大部分是由致病性大腸埃希菌所致，分離的48 株大腸桿菌菌株其中O8血清型有21 株，為優勢血清型，O20血清型有3 株，O45血清型有3 株，O60血清型有5 株，O139血清型有5 株，O141血清型有3 株，O149血清型有8 株。 初步確定了赤峰地區豬場中大腸埃希菌的主要菌株的血清型，O8血清型是引起本地區仔豬腹瀉的最主要血清型菌株，O149次之， 這對本地區仔豬大腸桿菌病的防治具有重要意義。