實驗室檢測新方法的驗證

張夢雪，李玉卡，王志恒，馬玉濤，吳建利

（1.石家莊市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心 050000；2.新樂市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 050000；3.石家莊市鹿泉區(qū)農(nóng)產(chǎn)品綜合質(zhì)檢站 050000）

實驗室在進行檢測活動時，需要控制很多關(guān)鍵要素，目的都是為了保障實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性， 檢驗方法的控制是其中一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 根據(jù)RB/T 214-2017《檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定能力評價 檢驗檢測機構(gòu)通用要求》 中要求：“在使用標(biāo)準(zhǔn)方法前，應(yīng)進行驗證”。 那么方法驗證的定義是什么？ 范圍包括哪些？如何進行方法驗證，步驟包括哪些？ 驗證的各項技術(shù)參數(shù)及其要求是什么？ 下面我們進行一一討論與分析。

1 方法驗證的定義與范圍

根據(jù)RB/T 214-2017《檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定能力評價 檢驗檢測機構(gòu)通用要求》、GB/T 32465-2015《化學(xué)分析方法驗證確認(rèn)和內(nèi)部質(zhì)量控制要求》、GB/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》、GB/T 27417-2017 《合格評定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗證指南》、NY/T 1896-2010 《獸藥殘留實驗室質(zhì)量控制規(guī)范》可知，方法驗證是指實驗室在引入方法前，通過進行核查，提供客觀有效的證據(jù)證明實驗室能夠滿足方法規(guī)定的要求，正確地運用該方法，以確保實現(xiàn)所需的方法性能。 如果原方法發(fā)布機構(gòu)修訂了該方法，應(yīng)根據(jù)需要重新進行驗證。 其范圍主要是標(biāo)準(zhǔn)方法，包括國際標(biāo)準(zhǔn)、國家（或區(qū)域性）標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)化主管部門備案的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[1-4]。

2 方法驗證的步驟

2.1 立項研討

實驗室首先應(yīng)當(dāng)集合技術(shù)負(fù)責(zé)人及相關(guān)技術(shù)骨干對此項目進行立項研討，詳細(xì)探討此項目的預(yù)期用途、適用范圍、開展的必要性、客戶的要求等[5]。 明確項目的立項必要性，同時對此項目開展工作進行初步分工，預(yù)先準(zhǔn)備進行人員、設(shè)備、試劑耗材及環(huán)境條件的工作。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)方法收集

業(yè)務(wù)辦公室標(biāo)準(zhǔn)查新負(fù)責(zé)人應(yīng)當(dāng)對確認(rèn)立項項目進行標(biāo)準(zhǔn)方法收集，選擇符合規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方法，同時保障標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)行有效[6]。 與檢測室相關(guān)人員進行溝通，根據(jù)立項目標(biāo)，選擇適宜的、盡可能符合目前檢測條件的標(biāo)準(zhǔn)方法，經(jīng)技術(shù)負(fù)責(zé)人確認(rèn)后，移交相關(guān)人員。

2.3 熟悉標(biāo)準(zhǔn)

檢測室、業(yè)務(wù)辦公室承擔(dān)本次新項目負(fù)責(zé)人應(yīng)當(dāng)盡快熟悉選定好的本立項標(biāo)準(zhǔn)，對標(biāo)準(zhǔn)關(guān)鍵點進行學(xué)習(xí)總結(jié)，同時整理需要配備的儀器設(shè)備、試劑耗材、環(huán)境保障設(shè)備。

2.4 人員培訓(xùn)

檢測室、業(yè)務(wù)辦公室承擔(dān)本次新項目負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)對本室內(nèi)人員進行培訓(xùn)， 保證抽樣及檢測人員可以滿足項目標(biāo)準(zhǔn)方法需求， 確保本室內(nèi)相關(guān)人員能掌握本標(biāo)準(zhǔn)方法的關(guān)鍵點， 可以正確、熟練使用本方法，并對方法結(jié)果進行正確評價[7]。

2.5 儀器設(shè)備及試劑耗材的配備

項目標(biāo)準(zhǔn)方法負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)檢查各室需要的的儀器設(shè)備、試劑耗材，按照實際情況需求，檢查已有儀器設(shè)備及試劑耗材能否滿足項目標(biāo)準(zhǔn)方法需求， 缺少的儀器設(shè)備及試劑耗材報相關(guān)部門審核、購買。 其中儀器設(shè)備主要檢查其檢測器性能、精密度、檢定校準(zhǔn)情況、維護保養(yǎng)情況等是否滿足需求；試劑耗材主要檢查種類、純度、有效期、驗收情況等，其中包含標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配備檢查[7]。 確保本室儀器設(shè)備及試劑耗材能夠滿足項目標(biāo)準(zhǔn)方法正常開展使用[8]。

2.6 環(huán)境條件配置、環(huán)境保障設(shè)備

項目標(biāo)準(zhǔn)方法負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)檢查本室內(nèi)環(huán)境條件配置、 環(huán)境保障設(shè)備是否滿足項目標(biāo)準(zhǔn)方法需要。 尤其是要確保滿足方法中特殊需求，如樣品保存過程冷鮮保存不可冷凍；檢測過程因見光分解需要避光條件等。

2.7 編制檢驗檢測規(guī)范、原始記錄表格、檢驗檢測報告格式

各室項目負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)分派任務(wù)，編制相應(yīng)檢驗檢測規(guī)范、原始記錄表格、檢驗檢測報告格式。

2.8 檢驗檢測樣品準(zhǔn)備

業(yè)務(wù)辦公室準(zhǔn)備相應(yīng)樣品，下達技術(shù)練兵流程卡。

2.9 開展檢驗檢測

檢測室根據(jù)流程卡安排相應(yīng)人員進行技術(shù)練兵， 檢測項目標(biāo)準(zhǔn)方法的各技術(shù)參數(shù)，主要包括線性、檢出限、定量限、準(zhǔn)確度/回收率、精密度、選擇性/特異性、穩(wěn)定性、不確定度等[9-10]。 具體各項技術(shù)參數(shù)的測試要求見下文。 各項技術(shù)參數(shù)的結(jié)果直接影響本項目標(biāo)準(zhǔn)方法驗證能否通過評審， 所以一般由技術(shù)骨干進行檢測或技術(shù)骨干牽頭檢測。 檢測過程中要做好原始記錄的填寫及各項技術(shù)參數(shù)的記錄與計算，保證原始記錄的真實可靠。

2.10 組織項目評審

應(yīng)當(dāng)組織技術(shù)負(fù)責(zé)人、 各室項目負(fù)責(zé)人及相關(guān)人員對項目各方面進行評審，包括人員、儀器設(shè)備及試劑耗材、環(huán)境保障、相關(guān)文件格式、原始記錄，尤其是對檢測過程中各技術(shù)參數(shù)指標(biāo)是否滿足項目標(biāo)準(zhǔn)方法需求，達到完成實驗的目標(biāo)[11]。 若各項均可達到要求，即可通過項目評審，此標(biāo)準(zhǔn)方法通過驗證。 方法通過驗證后，才證明實驗室具備檢測此方法的能力，可以申請擴項。

3 方法驗證的各項參數(shù)及測試要求

3.1 線性

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法的要求， 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)一般使用單點校正或校正曲線校準(zhǔn)。 如果分析方法采用校正曲線法進行分析物的定量，在方法驗證中就需要進行曲線的線性測定。 可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定的濃度進行測定，一般含有5 個濃度點或6 個濃度點（不包括空白）。 若沒有明確的濃度規(guī)定，可自行確定濃度范圍，一般會覆蓋一個數(shù)量級，同時保證被測濃度在校準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。 若此標(biāo)準(zhǔn)方法為定性或半定量方法，對校正曲線的要求相對較低，其線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)不應(yīng)低于0.98，若此標(biāo)準(zhǔn)方法為定量方法，則其相關(guān)系數(shù)不應(yīng)低于0.99[12]。

3.2 檢出限及定量限

在一般方法中，均會給出方法檢出限及定量限，即可在給定的方法檢出限、定量限的基礎(chǔ)上，對方法檢出限、定量限進行驗證，即使用空白基質(zhì)按照方法要求添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，通過前處理方法進行處理，使用儀器對添加樣品進行測定，驗證給定的方法檢出限及定量限，根據(jù)相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 32465-2015，分析結(jié)果應(yīng)在給定的方法檢出限±20%范圍內(nèi)。

若方法沒有給出方法檢出限及定量限， 則需要選擇適當(dāng)方法自行確認(rèn)，如使用信噪比法、空白標(biāo)準(zhǔn)偏差法、校準(zhǔn)方程適用范圍法等。 如信噪比法：將添加的相應(yīng)濃度的試樣檢測出的信號值與空白基質(zhì)樣品同時經(jīng)過方法前處理， 上機后檢測出的信號值進行比較， 若比例為3∶1 時確定相應(yīng)的濃度為方法檢出限；若比例為10∶1 時確定相應(yīng)濃度為方法定量限。

在確定方法檢出限與定量限時，檢出限要求低于定量限，確定最低定量限時，應(yīng)當(dāng)考慮本項目的國家規(guī)定的最高殘留限量，根據(jù)NY/T 1896-2010 規(guī)定，國家規(guī)定的禁用藥物的方法定量限盡可能的低，一般至少低于或等于1μg/kg（L）;國家規(guī)定了最高殘留限量的，方法定量限一般推薦如下：

表1 方法定量限與國家規(guī)定最高殘留限量關(guān)系

3.3 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度是指待測樣品按照方法處理后，上機，測量出的數(shù)值與“真值”的接近程度。 驗證方法的準(zhǔn)確度，可以通過在空白基質(zhì)樣品中添加適量濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測算回收率得到。 一般至少選取3 個添加濃度，禁用藥物一般選取定量限、兩倍定量限、十倍定量限3 個水平濃度， 有國家規(guī)定的最高限量值的一般選定量限、限量值、兩倍限量值作為3 水平濃度，每一水平每批5 個樣品，至少3 批。

回收率的建議偏差根據(jù)不同的國標(biāo)有所不同， 可以根據(jù)具體需要，選擇所依據(jù)的國家標(biāo)準(zhǔn)。不同標(biāo)準(zhǔn)回收率范圍見表2、表3、表4。

3.4 精密度

精密度是指多個、多批的待測樣品在相同的測量條件下，按照同種方法處理后，上機，測量出的數(shù)值互相的接近程度。 一般分為重復(fù)性（批內(nèi)精密度）及再現(xiàn)性（批間精密度）。 重復(fù)性（批內(nèi)精密度）是指在相同人員、時間、地點的實驗條件下對同個試樣測得的精密度；再現(xiàn)性（批間精密度）是指在不同地點、不同時間、不同人員對同個試樣得的精密度。 一般精密度以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（變異系數(shù)）表示。

表2 GB/T 27417-2017 與GB/T 27404-2008 規(guī)定的回收率偏差范圍

表3 GB/T 32465-2015 規(guī)定的回收率偏差范圍

表4 NY/T 1896-2010 回收率偏差范圍

在驗證方法的重復(fù)性，即批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差時，同樣采取同一空白基質(zhì)樣品添加一定濃度水平標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的方法， 禁用藥物一般選取定量限、兩倍定量限、十倍定量限3 個水平濃度，有國家規(guī)定的最高限量值的一般選定量限、限量值、一個合適的濃度作為3 水平濃度，每個濃度至少重復(fù)6 次，計算其變異系數(shù)[13]。驗證重現(xiàn)性（批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差） 時，同樣使用上述濃度，每個濃度至少重復(fù)6 次，至少進行3 批次實驗，計算變異系數(shù)。 變異系數(shù)應(yīng)當(dāng)符合相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)，表5 為NY/T 1896-2010 規(guī)定的批內(nèi)變異系數(shù)及批間變異系數(shù)。

表5 不同待測濃度的協(xié)同試驗精密度要求

3.5 其他

其他需要測定的參數(shù)如選擇性/特異性、穩(wěn)定性、不確定度、基質(zhì)效應(yīng)、測量區(qū)間等，具體項目根據(jù)實際情況進行驗證。