EB病毒潛伏期膜蛋白1與自身免疫性疾病關系的研究進展

(青島大學附屬醫院風濕免疫科，山東 青島 266003)

自身免疫性疾病是環境因素作用于遺傳易感個體導致的固有免疫和適應性免疫多個環節異常而引發的自身免疫損傷性疾病。多種病毒和細菌感染參與自身免疫性疾病的發生與發展，如腸道菌群失調為炎癥性腸病、類風濕性關節炎(RA)、多發性硬化(MS)的發病誘因[1-2]；人巨細胞病毒感染與系統性紅斑狼瘡(SLE)、系統性硬化(SSc)有關[3]。EB病毒(EBV)是一種廣泛流行于人群中的人類皰疹病毒，研究表明EBV感染與SLE、干燥綜合征(SS)、MS、RA等多種自身免疫性疾病相關[4-5]。EBV潛伏期膜蛋白1(LMP1)基因是引起EBV致瘤性的關鍵基因，LMP1為EBV編碼的表達于EBV感染細胞膜表面的蛋白，參與多種自身免疫性疾病相關細胞因子如B淋巴細胞活化因子(BAFF)、B淋巴細胞表面標志物CD23、干擾素(IFN)等的調控[6-9]，可以模擬CD4+T細胞表面CD40配體從而促進B淋巴細胞活化與分化[10]。本文主要總結EBV的感染特點，梳理LMP1在自身免疫性疾病的發生發展中的作用及其機制。

1 EBV的結構及EBV感染的特點

EBV為人類皰疹病毒Ⅳ型，是長為172 000 bp的線性雙鏈DNA，衣殼呈二十面體立體對稱，其衣殼主要由相對分子質量分別為160 000、47 000以及28 000的一組蛋白構成，包膜為脂質雙層膜。其基因組編碼的主要抗原包括：病毒衣殼抗原(VCA)、早期抗原(EA)、核抗原(EBNA)、LMP、膜抗原(MA)和小分子非編碼核糖核酸(EBER)、BamHI-A片段轉錄產物(BART)等。EBV廣泛流行于人群中，全球多數人口呈EBV潛伏性感染狀態[11-12]。

EBV主要通過唾液接觸傳播。發生于兒童時期的EBV原發性感染通常表現為輕癥或無癥狀；青春期或成人期獲得的原發性感染可引起傳染性單核細胞增多癥[13]。EBV的外膜糖蛋白gp350/220能夠特異性識別和結合B淋巴細胞表面分子CD21，通過受體介導的細胞內吞作用進入被感染細胞，其余種類的EBV膜糖蛋白如gp85、gp42等也參與病毒的穿膜與吸附等過程[14]，使得人B淋巴細胞成為EBV感染的靶細胞。在原發性感染發生后，EBV以潛伏感染形式存在于記憶B淋巴細胞中，逃避宿主免疫系統并防止受感染的細胞凋亡[15]，一旦宿主免疫力低下或環境發生改變時，EBV可被激活從而大量復制產生新的病毒個體，進而感染上皮細胞、淋巴細胞與自然殺傷細胞[16]，EBV侵犯上皮細胞的途徑也可能通過病毒外膜糖蛋白與CD21分子的結合來完成。EBV在淋巴細胞和上皮細胞發生的復雜感染狀態，是導致多種自身免疫性疾病與淋巴瘤等疾病的機制。

大部分慢性EBV感染者處于潛伏期感染狀態。潛伏期感染指大約1/10萬～1/萬的B淋巴細胞感染，但部分細胞中的病毒不進行復制與繁衍，僅表達10余種基因產物[17]，這種病毒產物低表達的現象是EBV能夠逃避免疫監視、造成潛伏期感染狀態的一個因素，導致EBV在體內長期存在而不被清除。潛伏期感染分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型3種類型，每一種類型見于不同的疾病且表達的病毒基因產物有所不同。Ⅰ型潛伏感染EBV僅表達EBNA1、EBER、BART，常見于BURKITT淋巴瘤；Ⅱ型潛伏感染EBV同時表達LMP1、LMP2、EBNA1、EBER、BART，可見于霍奇金淋巴瘤、胃癌、鼻咽癌、NK/T細胞淋巴瘤，其中LMP1的表達是Ⅱ期潛伏期感染的標志[18]；Ⅲ型潛伏感染EBV表達更多基因產物，包括EBNA2、EBNA3A-C在內的全部潛伏蛋白，見于免疫母細胞性淋巴瘤、淋巴組織增生性疾病(PTLPD)、傳染性單核細胞增多癥、彌漫性大B細胞淋巴瘤[19-20]。

2 EBV感染與自身免疫性疾病的相關性

多項臨床試驗和動物實驗研究顯示，EBV潛伏期感染與自身免疫性疾病相關。在EBV潛伏感染期間，一方面病毒可通過上調抗凋亡基因如bcl-2抑制感染的B淋巴細胞的凋亡造成其數量的增多；另一方面通過分子模擬機制，例如模擬T淋巴細胞CD40配體，促進B淋巴細胞的活化。因此B淋巴細胞數量增多與活化促進了自身免疫反應的發生。研究顯示，年輕SLE患者中EBV感染率為99%，而同年齡段健康對照組為70%[21]；RA患者外周血中EBV陽性的B淋巴細胞數量同樣高于正常人群[4]。動物實驗研究發現，小鼠體內LMP1、LMP2A、EA、MA的過表達能夠促進B淋巴細胞生成SLE相關自身抗體，其表達水平可能成為SLE診斷以及評估病情嚴重程度的潛在的生物標志物[22]。EBV與MS相關性較強，MS患者幾乎100%有EBV潛伏期感染的血清學證據，即在患者血清中同時出現了VCA-IgM以及EBNA1 IgG抗體[23]，兒童期感染EBV的個體與未感染者相比患MS的概率高15倍左右[24]。此外，EBV感染導致的上皮細胞損傷及其對固有免疫與適應性免疫的刺激均可以誘發SS的發生[25]。

感染個體針對EBV轉錄產物產生的抗體可與其自身抗原產生交叉反應，即抗EBV相關抗體與個體自身抗原之間具有相同的抗原決定簇。如抗EBNA1抗體與自身雙鏈DNA(dsDNA)及異質性核糖核蛋白(hnRNPL)之間便產生交叉反應，抗EBNA1抗體與dsDNA產生的交叉反應在小鼠體內能夠通過共同表位以及表位擴展誘導小鼠產生抗dsDNA抗體[26]；MS患者的腦脊液中存在的抗EBNA1抗體與患者自身hnRNPL產生的交叉反應通過類似的機制促進了抗hnRNPL自身抗體的產生[27]。

3 LMP1基因與LMP1蛋白在EBV感染中的主要功能

LMP1基因是關鍵的致瘤基因，表達于Ⅱ、Ⅲ型EBV潛伏性感染過程中，對于EBV致瘤、EBV潛伏感染狀態的維持以及EBV在體外轉化原代B淋巴細胞為永生化淋巴母細胞過程中起重要作用。LMP1是由LMP1基因編碼的表達于EBV感染細胞膜表面的一種蛋白，其完整結構包括由162個氨基酸組成的6個疏水跨膜區域，由23個氨基酸組成的N端和由200個氨基酸組成的C端[28-29]。LMP1并不需要配體的結合和激活，其C末端的兩個結構域——CTAR1和CTAR2可分別與腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF)和腫瘤壞死因子受體相關死亡結構域(TRADDD)蛋白分子結合而激活核因子κB(NF-κB)，繼而刺激B淋巴細胞免疫球蛋白基因的表達[30]，此作用與輔助性T細胞(Th細胞)CD40配體通過CD40介導的作用相似，使B淋巴細胞處于類似被Th細胞輔助的活化狀態，NF-κB的激活還下調了Toll樣受體9(TLR9)的表達，這有助于維持EBV的潛伏感染狀態[31]。LMP1導致的NF-κB通路活化是其致病性的重要原因，盡管生理性NF-κB通路的活化對淋巴細胞至關重要，但過度活躍的NF-κB信號傳導能夠促使炎癥性疾病與癌變的發生[32]。另外，LMP1也影響絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)、干擾素調節因子7(IRF7)以及STAT等多種細胞通路。例如LMP1可以通過PI3K/AKT/FOXO3a信號通路調控人miR-21導致鼻咽癌的發生[33]，通過激活MAPK通路影響細胞侵襲和轉移等。

4 LMP1細胞調控功能與自身免疫性疾病的關系

4.1 LMP1對淋巴細胞活化因子(BAFF)生成的促進作用

BAFF又稱B淋巴細胞刺激物(BLyS),主要由單核細胞、樹突狀細胞及T細胞產生，屬于腫瘤壞死因子(TNF)家族，在人體內具有刺激B淋巴細胞增殖與誘導免疫球蛋白生成的作用[34],在SLE、IgA腎病、SS和RA患者的血清中BAFF水平較正常人群升高[35]。且有研究表明，一些自身免疫性疾病患者血清中BAFF升高水平與疾病的嚴重程度及致病性自身抗體的水平呈正相關[34,36]。

LMP1促BAFF生成的機制已被多項研究證實。CD4+T細胞表面CD40配體與樹突狀細胞表面CD40結合后可上調樹突狀細胞BAFF表達，由于表達于EBV主要靶細胞——B淋巴細胞表面的LMP1可以模擬CD4+T細胞表面的CD40配體，因此其通過模仿CD40信號傳導起到上調B淋巴細胞BAFF表達的作用[7]。BAFF基因啟動點至少含有6個NF-κB結合位點，NF-κB的非經典激活途徑對于上調BAFF蛋白表達至關重要[37]，LMP1 C末端的CTAR1與CTAR2結構域可與TRAF結合而激活NF-κB，實驗表明，LMP1可通過CTAR結構域以及TRAF上調BAFF表達[7,38]。

4.2 LMP1對B淋巴細胞表面標志物CD23表達的影響

CD23是B淋巴細胞和單核細胞表面的一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，屬于C型動物凝集素超家族，為B淋巴細胞活化的標志。CD23脫落可以形成可溶性CD23(sCD23)，是一種自分泌的B淋巴細胞生長因子(BCEF),可與CD21結合激活磷脂肌醇信號途徑(PKC)，導致B淋巴細胞的增殖。因此，CD23加重風濕病的機制可能是其促進B淋巴細胞的分化成熟而阻止其凋亡，使之呈現高反應性，進而合成和分泌自身抗體，加重自身免疫性反應。在SS、SLE患者組血清中sCD23均較正常人群高，活動期SLE患者經過有效治療后外周血sCD23表達可降低[39]。體外實驗證明，電穿孔法轉染LMP1重組質粒可使人B淋巴瘤細胞株Lockes和BJAB的CD23表達量升高[8]。另一項研究發現，SS患者病理損害重的唇腺組織LMP1陽性表達程度較強，其中，CD23陽性表達部位多在呈灶狀浸潤的淋巴細胞區域，腺泡以及導管周圍浸潤的淋巴細胞上也可見陽性表達，LMP1在唇腺組織中主要表達于腺泡上皮細胞及小導管上皮細胞中，部分位于浸潤的淋巴細胞中，而CD23的表達程度與LMP1呈正相關[40]。

4.3 LMP1基因及LMP1蛋白與IFN的關系

IFN是一類可以抑制病毒感染、調節免疫功能的細胞因子，通過誘導細胞表達多種蛋白質而發揮生物學功能，編碼這些功能蛋白質的基因稱作干擾素刺激基因(ISGs)，約有10余種。SLE和其他自身免疫性疾病患者中有IFN水平增高的現象，IFN在這些疾病發展過程中具有多種作用，如在SLE模型小鼠和SLE人群中，過量的IFNα能夠減少NO生成，造成血管內皮功能障礙[41]。以往研究還發現，SLE病人外周血淋巴細胞中LMP1基因mRNA表達較正常人明顯升高，并且與OASL、ISG15、LY6E等ISGs的表達呈顯著正相關[42]。IRF是一類能夠對IFN基因表達進行調控的多功能轉錄因子，共有9個成員，IRF7是誘導IFN產生的重要調節因子，IRF7的降解能夠阻斷IFNα和IFNβ的表達[43]，SLE患者IRF7基因mRNA水平較正常人高，且與IFN水平及系統性紅斑狼瘡疾病活動度(SLEDAI)積分呈正相關，SLEDAI積分是反應SLE疾病活動程度的指標，因此可以認為IRF7基因表達異常影響著SLE的發病及其病情進展[44]。體外實驗證實LMP1可以誘導EBV潛伏性感染的B淋巴細胞產生Ⅰ型IFN，其作用機理是LMP1具備活化和募集轉錄因子IRF7的作用，同時，IRF7也可以被LMP1激活，共同促進IFN的產生。由于IFN的抗病毒特性有助于EBV建立或者維持潛伏期狀態，因此LMP1這種促IFN產生的效應屬于維持EBV潛伏性感染的機制之一[45]。盡管SLE中引起過量Ⅰ型IFN的首要原因是免疫復合物的形成，且產生Ⅰ型IFN的主要細胞是樹突狀細胞[46]，但LMP1作為一種影響因子，可能通過參與激活IRF7以及其本身的類IRF7作用促進IFN的產生，繼而造成IFN下游ISGs表達增強，參與SLE的發生與進展。

4.4 LMP1與CD4+T細胞CD40配體的關系

CD40是與T淋巴細胞和B淋巴細胞功能均有關的一種表面抗原，可表達于B淋巴細胞、單核/巨噬細胞、樹突狀細胞、胸腺上皮細胞等多種細胞表面，CD40配體是一種表達于CD4+T細胞表面的活性蛋白，CD40信號具有活化PI3K等細胞通路與上調bcl家族表達的作用。LMP1可模擬CD4+T細胞的共刺激分子CD40配體從而與CD40分子競爭性結合TNF等因子，產生上調抗凋亡基因bcl-2而抑制促凋亡基因bax的作用，促進了B淋巴細胞的轉化與增殖[47]。因此，LMP1使EBV感染的B淋巴細胞抗凋亡能力增強，當與CD4+T細胞隨血液循環至全身器官時，后者可通過接受感染的B淋巴細胞產生的共刺激生存信號致細胞凋亡減少，產生多種細胞因子趨化炎癥細胞，進而導致機體器官的損害[48]。

4.5 LMP1干預與自身免疫病的關系

目前針對LMP1治療自身免疫性疾病的方法較少。已發現風濕性疾病常用藥——雷公藤內酯醇能夠降低EBV陽性的B淋巴細胞存活率，其作用機制有可能是通過抑制LMP1的ED-L1啟動子，下調EBV陽性B淋巴細胞中的LMP1的表達以及轉錄水平[49]。

LMP1在EBV感染過程中介導的信號網絡非常復雜，其多重生物學功能是多通路相互協同與影響的結果。深入了解LMP1在EBV感染過程中發生的作用，有助于了解EBV相關自身免疫性疾病的發病機制，也有助于研究如何通過干預LMP1來治療EBV感染相關疾病。