Wnt/β-catenin信號通路在胃癌中的研究進展

王騫，譚林，屈偉明，陳維順

(中南大學湘雅醫學院附屬株洲醫院消化內科，湖南 株洲 412007)

胃癌已成為威脅人類健康的重要疾病之一，我國是胃癌高發國家，發病率和死亡率均居第二位[1]。胃癌的發生與發展是一個多基因、多階段、多途徑參與的復雜病理過程，其發展過程中有眾多復雜的分子生物學變化。目前，胃癌的早期診斷仍是一個棘手的難題，多數患者確診時已處于晚期，無論是手術或是非手術治療效果均不理想。因此，研究胃癌發生、發展的機制，尋找胃癌發病的關鍵因子并提高早期診斷率是改善患者預后的重要手段，也可為藥物或生物治療提供靶點。其中，對細胞信號轉導通路與胃癌發病關系的研究是目前生物醫學領域的熱點，而Wnt/β聯蛋白(β-catenin)信號通路是調控細胞增殖、分化的關鍵信號通路之一，其多個靶點被證實與胃癌發病密切相關。現就Wnt/β-catenin信號通路中各組分及相關基因突變參與胃癌的發生、發展予以綜述，包括腫瘤細胞的癌變、侵襲與轉移和相關治療，以為胃癌的防治研究提供新思路。

1 Wnt/β-catenin信號通路概述

胃癌的發生通常是一個長時間的慢性演變過程，與癌基因過度激活、抑癌基因失活或調控失效、凋亡與抗凋亡基因的表達失衡等多種因素有關。研究表明，包括Fas/Fas 配體、Notch、c-Jun氨基端激酶、核因子κB及Wnt等多條與細胞增殖、生長有關的細胞信號轉導通路與胃癌的發生發展有關[2-4]。其中，Wnt通路是調節細胞增殖、分化、遷移、凋亡等生理活動的關鍵信號通路之一。Wnt通路分為經典Wnt/β-catenin通路與非經典Wnt/Ca2+、Wnt/平面細胞極性通路。Wnt/β-catenin通路的傳導方式為：配體蛋白與細胞膜表面的低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6及卷曲蛋白結合形成三聚體，通過蓬亂蛋白減弱由軸蛋白(Axin)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、結直腸腺瘤性息肉(adenomatous polyposis coli,APC)基因組成的降解復合物與β-catenin結合的穩定性，抑制β-catenin降解。β-catenin轉入細胞核內，與T細胞轉錄因子/淋巴樣增強因子相互作用活化下游靶基因。Wnt/β-catenin信號通路活化的核心為β-catenin在胞質內積聚后向胞核內轉移，而通路中任意組分發生變化均可導致信號轉導異常。

正常胃上皮細胞中，Wnt配體蛋白在所有細胞中均表達，但僅在胃小凹基底部存在Wnt信號的激活。其原因為黏膜肌層的成纖維細胞可分泌特異性頂部盤狀底板反應蛋白(Roof plate-specific spondins，Rspos)[5]。Rspos是新近發現的一種分泌蛋白家族，可穩定Wnt受體并增強Wnt/β-catenin信號轉導。生理情況下，Wnt/β-catenin信號通路在激活下游靶基因的同時激活E3泛素化連接酶[環指蛋白43(ring finger protein 43，RNF43)/鋅環指蛋白3(Zinc and ring finger 3，ZNRF3)]，其介導配體蛋白/卷曲蛋白/低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6三聚體泛素化內吞而降解以下調信號轉導，此負反饋作用是平衡Wnt信號的重要機制。而Rspos與其受體富含亮氨酸的重復G蛋白偶聯受體(leucine rich repeat containing G protein coupled receptors,LGRs)結合為二聚體后，可消除RNF43/ZNRF3對Wnt/β-catenin通路的抑制作用，導致通路的持續活化[6]。研究表明，缺乏Rspos小鼠胃上皮干細胞的增殖能力明顯下降[2]。Yan等[7]的研究也證實，消耗Rspos會導致胃內LGR5+干細胞數量減少，且加強Wnt信號也無法恢復干細胞數量，提示Rspos信號的正常傳導是維持胃上皮干細胞增殖的關鍵。

2 Wnt/β-catenin信號通路與幽門螺桿菌感染

遺傳因素與環境因素共同導致胃癌的發生，幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是一種主要定植在人胃黏膜上皮的革蘭陰性桿菌，Hp感染可誘導多種炎癥介質產生，并引起胃黏膜慢性炎癥及萎縮性改變。Hp感染是胃癌最重要的致病因子與危險因素，早在1994年Hp就被世界衛生組織定為胃癌的Ⅰ類致癌因子。目前公認的胃癌發生模式為正常胃黏膜、慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、異性增生、胃癌，Hp感染是這一連續病變過程的始動與促進因子，全球范圍內約80%的胃癌與Hp感染有關，且Hp感染者胃癌發生的危險是無感染者的4～6倍[8]。同時，Hp是胃癌中最重要的可控因素。一項大規模研究表明，根除Hp可有效降低胃癌的發病風險及術后腫瘤復發率[9]。

Hp中有幾種與胃癌發生有關的毒力因子，其中Hp細胞毒素相關蛋白A(cytotoxin-associated protein A，CagA)最為重要。Hp在胃上皮細胞種植后，通過分泌蛋白系統將CagA “注射”入宿主細胞內，CagA主要通過磷酸化胃黏膜上皮宿主細胞內的酪氨酸殘基而影響宿主細胞內的多條相關信號通路的傳遞[10]。CagA可以干擾GSK-3β誘導的β-catenin降解，導致β-catenin的穩定化及核易位，并啟動下游靶基因表達，促進上皮細胞增殖[11]。Liu等[12]研究發現，Hp陽性胃癌中β-catenin的表達水平明顯高于陰性胃癌。Hiroko和Masanori[13]對CagA基因序列多態性的研究發現，CagA中EPISA序列可通過磷酸化解除宿主細胞蛋白酪氨酸磷酸酶2的抑制作用，蛋白酪氨酸磷酸酶2是一種致癌因子，可通過活化Wnt/β-catenin信號轉導通路促進有絲分裂及細胞形態學改變，從而參與胃癌的發生。此外，CagA還可以抑制GSK-3β，促進胃癌的上皮-間充質轉化[14]。Hp可影響Wnt信號在細胞間的傳導，Rspos信號對Wnt/β-catenin通路的活化是維持胃內干細胞增殖的關鍵,Hp可以誘導腺體基底部成纖維細胞分泌Rspos(特別是Rspo3)，導致胃干細胞的過度活化、增殖[2]。同時，Hp在胃黏膜定植后還能通過細胞間連接與胃干細胞直接通訊和相互作用，并刺激胃干細胞潛能的活化，此種效應也是基于Rspos-Wnt/β-catenin信號通路的活化[15-16]。但目前Hp是如何影響Rspos分泌，及其與干細胞之間的通訊連接的詳細機制仍不完全清楚，其對胃內干細胞的激活后是如何導致腫瘤癌變的機制仍缺乏研究。

3 Wnt/β-catenin信號通路與胃癌的發生及發展

Wnt/β-catenin信號通路是導致胃癌發生及發展的最重要的信號通路之一。對于消化系統，Wnt/β-catenin信號通路不僅調控細胞增殖、分化，還與調節干細胞的生物學活動有關。胃腸道干細胞增殖、分化失控是導致腫瘤發生發展的重要原因，如促進腫瘤細胞的自我更新及上皮-間充質轉化等[5]。研究表明，Wnt/β-catenin信號通路的異常活化可能是導致腫瘤級聯反應的關鍵步驟，目前約30%的胃癌中發現了Wnt/β-catenin信號通路成員的病理激活[17]。迄今為止，胃癌中Wnt/β-catenin信號通路的增強機制主要有配體表達增加、基因突變、表觀遺傳學改變及微RNA(microRNA，miRNA)調控異常等。

3.1Wnt配體表達增加 Wnt通路配體蛋白表達增加是較早被發現的機制。Saitoh等[18]首先發現，Wnt5a在超過30%的胃癌中顯著上調。另外，Wnt1[19]、Wnt6[20]和Wnt10a[21]等Wnt配體蛋白在胃癌中表達增強。而Rspos作為新近發現的Wnt/β-catenin信號通路的強效激活劑，其在胃癌中的研究也逐漸增多。Li等[22]在對人胃癌異體移植模型的研究發現，部分胃癌中存在類似于結腸癌中的Rspo2基因融合現象，起到類似增強子的作用，可增加體外轉染腫瘤細胞的增殖速度及誘導實驗小鼠腫瘤形成，提示Rspo2在胃癌中有促癌作用。有研究報道Rspo1、Rspo2在腸型胃癌中的表達明顯增加，與癌旁組織相比，雖然胃癌組織中的染色強度下降，但染色陽性細胞數量增加，這是免疫反應促使機體沉默Rspos表達以抑制腫瘤細胞的表現[23]。Zhang等[24]在胃癌標本及細胞系中也發現，Rspo2與LGR5的表達水平均明顯高于正常胃黏膜細胞，兩者在腫瘤細胞的表達呈正相關，在抑制Rspo2的表達后，組織內上皮鈣黏素的表達增加、β-catenin及波形蛋白表達減少[24]。而Shamai等[25]發現，間充質干細胞在經胃癌細胞招募及誘導“重編程”后可提高Rspos及LGR5在組織中的表達，以維持腫瘤細胞的增殖、生長，提示Rspos-LGR5-Wnt/β-catenin信號通路不僅與胃癌的發生有關，還可通過影響上皮-間充質轉化在胃癌的侵襲、轉移中發揮作用。

3.2基因突變與表觀遺傳修飾 基因突變導致Wnt/β-catenin信號通路的異常活化也是胃癌發生的一種機制。Min等[26]的研究發現，將近20%的胃癌中出現了APC基因突變導致的Wnt/β-catenin信號通路的活化。另有學者在軸蛋白1和軸蛋白2中也發現了因編碼基因突變而導致兩者功能失活的情況[27]。Gao等[28]對胃癌組織標本進行基因組測序后發現，RNF43在胃癌中常因基因突變導致表達減少，且與TNM分期、遠處轉移等有關。Niu等[29]對胃癌細胞系的研究進一步證實了RNF43的功能缺失突變，且RNF43的失活可導致癌細胞增殖性更強，Ki67活性更高。而誘導RNF43過表達抑制Wnt信號活化，可明顯減弱腫瘤細胞的增殖能力及侵襲能力。有研究發現，35.2%的早期胃腺癌及腺瘤中發生RNF43基因突變，提示RNF43的下調可能是腺瘤向腺癌轉變的早期特征之一[26]。

表觀遺傳修飾指在不改變DNA序列的情況下，通過DNA甲基化、組蛋白修飾等方式調控細胞的生物學行為。在胃癌中，APC基因不僅經常發生突變，而且也常因出現甲基化而失活。有研究報道，52.9%的胃癌組織出現APC基因甲基化，甲基化程度明顯高于正常組織[30]。Yu等[31]對胃癌DKK3(Dickkopf3)基因進行轉錄調節和功能分析時發現，有68%的早期胃癌組織中檢測到DKK3啟動子甲基化，提示DKK3的甲基化可能是早期胃癌的特征。宋國棟等[32]發現，胃癌中DKK3啟動子存在異常甲基化，且程度與腫瘤浸潤深度、TNM分期及轉移等密切相關。此外，胃癌中分泌型卷曲相關蛋白5也存在異常甲基化[33]。

3.3miRNA調控異常 miRNA在胃癌的發生發展中起重要作用，可通過包括調控細胞信號轉導通路在內的多種機制影響腫瘤細胞的增殖生長。一項總結了352 種miRNA在胃癌中表達情況的研究顯示，近70種miRNA在胃癌中存在表達異常[34]。Cong等[35]利用免疫熒光雜交實驗發現，胃癌中miR-200a的表達明顯下調，其可通過誘導上皮鈣黏素的表達抑制Wnt/β-catenin信號通路發揮抑癌作用。同時，miR-1225-5p在胃癌中的表達下調與腫瘤的侵襲轉移及不良預后密切相關[36]。此外，某些miRNA表達增加會促進腫瘤的發展，胃癌中過表達的miR-544a可抑制上皮鈣黏素基因表達，從而引起腫瘤細胞上皮-間充質轉化的發生，且miR-544a還可通過減少軸蛋白2的表達增強β-catenin核易位促進胃癌的侵襲[37]。有研究表明，在胃癌細胞系及胃癌組織中存在miR-194過表達，其通過與Wnt/β-catenin信號通路抑制受體結合而引起Wnt/β-catenin信號通路的異常活化并導致腫瘤細胞的增殖，且抑制miR-194表達可以明顯降低體外胃癌細胞的侵襲與轉移能力[38]。同樣，在胃癌中表達上調且與Wnt/β-catenin信號通路相關的miRNA還有miR-501-5p[39]、miR-324-3p[40]、miR-438-5p[41]等。可見， miRNA通過調控Wnt/β-catenin信號通路不僅與胃癌的發生有關，而且還與胃癌細胞的侵襲、轉移能力有關，并在一定程度上影響了胃癌患者的預后。

4 Wnt/β-catenin信號通路與胃癌的治療

Wnt/β-catenin信號通路的活化不僅與胃癌的發生有關，還與胃癌患者的預后密切相關。Wnt/β-catenin的靶基因LGR5在胃癌中的表達與病理分期有關，且LGR5陽性胃癌患者術后復發、轉移以及5年生存率均明顯低于LGR5陰性患者[42]。另外，Wnt信號通路拮抗劑DKK3甲基化[31]及RNF43基因突變[26]均與腫瘤細胞化療抵抗及預后不良有關。由于Wnt/β-catenin信號通路的失調是導致胃癌的主要病理因素之一，因此通過靶向藥物調節異常Wnt/β-catenin信號轉導而治療胃癌成為近年的研究熱點。Flanagan等[43]對胃癌異種移植模型的研究發現，使用Wnt5a抑制劑可有效降低肝轉移率，并可減少轉移瘤數量，卷曲蛋白抑制劑亦可以抑制腫瘤生長。

DKN-01是一種DKK1的單克隆抗體，其針對遠端胃癌(胃食管交界部腫瘤)患者的治療已進入臨床Ⅰ期階段[44]。另一種藥物IWP-2可通過抑制Wnt配體蛋白分泌阻斷Wnt/β-catenin信號通路，從而抑制腫瘤生長[45]，現已經開始進行臨床試驗。而一項以Rspo3為靶點的靶向藥物也已進入針對結直腸癌Ⅰ期臨床試驗階段[46]，未來有望應用于胃癌的治療。此外，針對現有胃癌治療藥物的研究也發現，獸用抗生素沙利霉素可通過抑制Wnt1相對選擇性地阻斷Wnt通路的激活，在動物實驗中沙利霉素可以有效抑制胃癌干細胞的活性與增殖能力，通過誘導其凋亡而顯示出抗腫瘤能力[19]。質子泵抑制劑(proton pump inhibitor,PPI)泮托拉唑可以通過抑制Akt/GSK-3β/β-catenin信號轉導，降低胃癌細胞的侵襲性與耐藥性，同時還可抑制腫瘤細胞的上皮-間充質轉化過程[47]。雖然PPI抑制Wnt/β-catenin通路的具體機制尚不明確，但這一發現提示PPI的某些作用位點可能是一個潛在的抗腫瘤靶點。Zhang等[48]發現，傳統中藥乳香的主要成分3-乙酰基-11-酮-β-乳香酸可以針對性地拮抗腫瘤細胞內Wnt/β-catenin信號，從而有效抑制胃腺癌細胞的生長，并不會對正常細胞造成影響。此外，經典的非甾體抗炎藥物布洛芬顯示出對胃癌干細胞的強抑制作用，Akrami等[49]發現布洛芬可通過改變CTNNB1、CTNNBIP1、SUFU、CASK、KREMEN1等基因的表達抑制Wnt/β-catenin信號通路，最終抑制體外胃癌干細胞的增殖、侵襲。然而，由于Wnt/β-catenin信號轉導過程中涉及的配體、受體的種類及數量均十分龐大，且通路本身參與對于正常生命活動有著廣泛而復雜的調節，目前針對Wnt/β-catenin信號通路的藥物仍處于實驗研究甚至是設想階段，距離臨床應用還有很大距離。

5 小 結

Wnt/β-catenin信號通路是維持胃內細胞穩態的關鍵信號通路，其正常傳導對維持干細胞特性及上皮細胞轉化等至關重要，是腺體內細胞命運和細胞多樣性的決定因素。同時，Wnt/β-catenin信號通路的激活是胃癌發生的關鍵驅動因素，參與對腫瘤細胞的周期調控，促進腫瘤細胞的增殖，參與細胞的上皮-間充質轉化，其對胃癌的發展、侵襲轉移乃至于耐藥性方面均發揮重要作用，并在很大程度上決定了胃癌患者的預后，而Hp感染可在一定程度上激活Wnt/β-catenin信號通路，加速胃癌的發生與進展。由于Wnt/β-catenin信號通路在胃癌中的重要作用，有望成為胃癌篩查、診斷及病情監測等的新興靶點。但由于Wnt/β-catenin通路的復雜性及對正常生命活動的重要性，現有的干預藥物仍存在巨大缺陷，截至目前絕大部分還處于實驗設計及體外細胞實驗階段，且還沒有任何一種藥物可以成功通過臨床試驗的所有階段。今后研究應重視胃癌中Wnt通路的特定成員改變，從而能夠應用個性化的治療策略采取針對性的治療，同時應繼續深入闡明胃癌的發生機制，尋找胃癌中Wnt/β-catenin信號通路活化的特異性標記分子，進一步完善Wnt/β-catenin信號通路的調控機制，為胃癌的治療提供更系統的理論基礎及更豐富的靶點選擇。