雙黃連注射液導致類過敏的物質基礎及作用機理*

韓依倫，夏 恒，段金連，段為鋼

（云南中醫藥大學中醫藥學分子生物學重點實驗室，云南 昆明 650500）

1 雙黃連注射液導致過敏的中醫理論

1.1 雙黃連注射液導致過敏的中醫病理病機 中醫學中“正氣”代表人體正常機能及所產生的各種維護健康的能力，“邪氣”泛指各種致病因素，疾病發生發展過程中，邪氣侵害和正氣虛弱都必不可少。衛氣作為正氣的一部分，常護衛于皮膚表面抵抗外邪[1]。人體臟腑功能正常時，衛氣對外固密，抵抗外邪。既然中藥注射液可導致過敏反應，可以認為其中含有邪氣并通過靜脈注射、肌肉注射等人為手段，突破皮膚，跳過了衛氣的部分防御功能，給予了外邪入侵的機會。

一般感染外邪，邪從皮毛而入，先中于衛，然后由衛入營，由營而入腑，由腑入臟，注射液中邪氣跳過衛，直接入營分，營主血脈，行于脈中，邪氣侵犯血脈，外不得透達，內不得疏泄，郁閉肌腠，則皮膚瘙癢，皮疹生出，發生過敏[2]，簡單來說，人體平時腠理較為密閉，可抵抗外邪入侵，當注射劑中的邪氣人為的注射入肌表后，由于腠理較密，反而使外邪并無向外的出路，郁閉在肌表則就會導致皮膚過敏性疾病的發生，嚴重者，病邪向人體內部入侵，如從臟腑辯證的角度來看，病邪入心，則胸悶，心痛，入脾胃則腹瀉嘔吐，從溫病學的角度來看，風邪侵襲腠理，入里化熱，熱入營血，血熱妄行，溢于皮膚，導致患者斑疹隱隱，更有甚者，還會導致厥證的發生，如臨床上突發的過敏性休克。

中醫通常將治病的邪氣分為外因，內因，不內外因。其中中藥注射劑治病無疑是外因所致，而外邪六淫中又以風邪與皮膚類疾病的關系最為密切[3]，風邪主要具有以下特點：（1）風邪清揚開泄，易襲陽位，發病部位多在人體頭面，肌表皮膚處。（2）風性善行而數變，即致病部位具有游移，行無定處的特點，且發病迅速，如風疹（蕁麻疹）表現為皮膚瘙癢時作，疹塊發無定處，時隱時現。（3）風為百病之長，風邪是侵襲人類致病最多的邪氣，終歲常在，發病機會多，且易于其他邪氣相互兼合，共同致病。風熱侵襲腠理，風寒外侵，導致營衛不和。

當風邪侵入人體之后，會流行于各經腧穴，分散在肉份之間，阻塞人體的氣道，與人體衛氣相互糾纏，影響衛氣的運行，從而導致過敏反應的發生。

綜上，風邪致病的特點與雙黃連注射液所導致不良反應十分接近，注射液中可能含有風邪等致病因素。

1.2 雙黃連注射液中的致敏邪氣的可能來源 雙黃連注射液由金銀花，連翹，黃芩組成，藥性均偏于寒涼，中藥注射液不同于傳統給藥方式，未經脾胃運化的作用，將具有偏性的藥物注入到人體表面，藥物是否會因為自身的寒涼等性質而導致人體過敏反應的發生。目前市場上中藥注射液按照功效可分為清熱類，活血類，補益類，腫瘤類，其中的藥物性味多有不同，但目前市場上各種中藥注射劑導致的不良反應幾乎都是以皮疹，隱疹等皮膚癥狀為多[4-5]，顯然藥物自身的性味并不是導致雙黃連注射液過敏的必然原因。目前的中藥注射液制備工藝還并不是很完善，制備的過程中還有不少雜質未去除，這有可能是導致中藥注射液發生過敏的一種或多種邪氣之一，且這些邪氣很有可能主要以風邪為主。

綜上所述，中藥注射液中大分子雜質可能是以風邪為代表的邪氣，將中藥注射液注入人體，相當于人為將邪氣引入人體，此時無關人體衛外正氣強弱，邪氣入體自然會引發人體一系列病癥，根據其入侵程度及與體內正氣交征情況，會導致人體一系列不同癥狀發生。

2 雙黃連注射液導致的過敏反應的類型

2.1 Ⅰ型過敏反應的機制和類過敏反應的機制 雙黃連注射液所致不良反應發生迅速[6-7]，屬速發型超敏反應，速發型超敏反應包括Ⅰ型超敏反應和類過敏反應，多數藥物所致過敏為前者，其過程分2個階段，第一階段抗原進入機體產生IgE抗體，抗體可專一性的與肥大細胞，嗜堿性粒細胞表面高親和力受體結合，機體再次接觸相同抗原時，細胞迅速活化釋放各種活性介質，導致過敏反應的發生。而類過敏首次用藥即可發生，不需IgE介導與提前致敏，但其機制目前尚未完全明確，可能與直接或間接刺激機體導致組胺等生物活性物質釋放增加有關。

2.2 雙黃連注射劑介導的是類過敏反應 因二者臨床上的表現相似，并沒明確證據表明雙黃連注射劑導致的不良反應是Ⅰ型過敏反應還是類過敏反應，但近年來越來越多的文獻與研究表示，雙黃連注射液的不良反應都是發生在患者的首次用藥，如楊燕妮等在144例雙黃連注射液不良事件中發現其中有136例（94.44%）不良反應是在首次用藥[7]。唐春燕等發現廣西壯族自治區ADR監測中心收集的818例雙黃連注射劑不良反應中777例（94.99%）是發生在首次用藥[8]，王麗娜等通過對66例雙黃連注射液導致的過敏性休克進行分析，發現其中58例（87.88%）發生在首次用藥[6]。由此可發現雙黃連注射劑所致的過敏反應不良的反應多數不需要提前致敏，一些實驗也表明通過雙黃連注射液致敏小鼠，并不會導致小鼠體內IgE抗體的產生，且其導致的過敏反應其程度會隨著其劑量的增加而增加[9-10]，由此可推斷雙黃連注射液的不良反應為固有免疫引起的類過敏反應。

3 雙黃連注射劑中的致敏物質基礎

雙黃連注射液成分復雜[11]，綠原酸、黃芩苷、連翹苷是目前納入雙黃連注射液質量標準含量測定的3種主要成分，國內外對于雙黃連注射液所致過敏反應的研究都普遍集中在這3種物質上。但雙黃連注射液是植物提取物，提取時會帶入植物中原生代謝物，如蛋白質，核酸，鞣酸，多糖等內源性大分子及以脂多糖為代表的來自藥材中的污染性大分子，這些大分子雜質很可能成為致敏原導致類過敏反應的發生[12-13]。

3.1 雙黃連中的小分子物質 有學者認為免疫原性物質相對分子質量通常大于1萬KD，小于5 000 KD的物質免疫原性則很弱[14]。綠原酸等小分子物質作為許多中藥注射劑中有效成分是否具有致敏性，目前尚存爭議。

有學者認為綠原酸等小分子屬于半抗原，可與人體內蛋白質相結合，形成半抗原-載體復合物，并導致機體I型超敏反應[15]，有研究發現將綠原酸和綠原酸完全抗原直接刺激肥大細胞模型RBL-2H3細胞并不會引起肥大細胞脫顆粒，而將RBL-2H3細胞與綠原酸或雙黃連致敏血清共孵育致敏后，可引起脫顆粒發生[16]。帥維維進行比較綠原酸和體外血清外孵后的綠原酸對BN大鼠的致敏性差異，結果發現綠原酸進入體內后可與血清蛋白結合形成復合物而產生免疫原性[17]。汪芳等采用RBL-2H3細胞模型，分別用雙黃連注射液、黃芩苷、連翹酯苷A、綠原酸等處理細胞，結果發現雙黃連注射液、綠原酸及隱綠原酸能直接引起RBL-2H3細胞脫顆粒，并能顯著提高細胞內β-氨基己糖苷酶和5-羥色胺的釋放[18]。

也有觀點認為小分子物質不會導致過敏反應的發生，如有學者對BN大鼠進行綠原酸被動皮膚過敏（PCA）和主動全身過敏（ASA）實驗，結果發現綠原酸沒有明顯的致敏性[19]。馮宇飛通過體內，外實驗觀察雙黃連針粉劑中綠原酸，黃芩苷，連翹苷對肥大細胞脫顆粒及組胺，類胰蛋白酶的釋放作用，發現這3種成分均不能引起類過敏反應[20]，也有文獻表明高濃度綠原酸并不會導致過敏，而其提取物中大分子物質才會致敏[21]。綜上，小分子致敏理論難以統一及證實，由此可推測是一些非小分子的被我們忽視的某些物質在起作用。

3.2 雙黃連中的大分子物質

3.2.1 大分子物質的來源分析 雙黃連注射液作為生物提取物，其中的來源可能如下：

（1）直接來源：來自植物的原生代謝物，如蛋白質、縮合鞣質、核酸、多糖、樹脂等，這些都是中草藥生長的必需物質或分泌物，屬于內源性大分子；另一部分則來自藥材污染如細菌脂多糖、蛋白質[22]等，可歸為外源性大分子[23]。

（2）間接來源：雙黃連注射液由“水醇法”制備，原料藥經過煮沸，酒精沉淀，殺菌等一系列工序，如加熱提取工藝，溶劑中一些成分可能發生氧化聚合，導致縮合鞣質的形成。

3.2.2 大分子物質的致敏性 這些大分子中蛋白質、核酸等可被機體的相應酶降解；多糖和脂多糖雖然可被網狀內皮系統吞噬，或因其水溶性，直接排出體外，但并不完全；而縮合鞣質等聚合物缺乏相應的降解酶，很難降解。

藥劑顏色可以在一定程度上反映藥物的質量，顏色越深則說明其成分越復雜，通過分子篩技術去除雙黃連注射液中的大分子雜質，可改善其外觀質量，且對主要療效和物質基礎影響甚微，如通過對家兔進行降溫實驗，去除大分子物質的注射液其解熱作用并不會降低[24]，經超濾管過濾大分子后，注射液安全性提高，指紋圖譜并無明顯變化[25]。這說明雙黃連注射液中的大分子物質的存在本身是無用甚至是有害的，很可能是導致過敏反應的物質基礎之一。

Lyaton認為大分子物質才是真正的致敏物質，綠原酸及其同分異構體廣泛的存在于高等植物中，如果綠原酸會導致過敏反應，那么對于人類的健康將是一大威脅[26]。馮文宇等用金銀花精、粗提取物注射液對豚鼠進行主動全身過敏試驗，結果發現只有粗提取物才出現陽性反應，并與注射液中含有蛋白質、樹脂、鞣質等雜質有關[21]。也有學者通過RBL-2H3細胞脫顆粒模型和BN大鼠進行體內外實驗，發現天然藥物注射劑中綠原酸、連翹苷等小分子化合物不能誘導RBL-2H3釋放組胺和β-氨基己糖苷酶。而大于10 kDa的蛋白質和鞣酸才是主要類過敏成分，且組胺水平會隨著試劑的濃度的增加而增加[27]，而其另一項研究也表明在血塞通中藥注射液中，大于10kDa的分子可以誘導類過敏反應的發生[28]。另一方面，也有研究提出當雙黃連注射劑長期放置后，其中的不溶性微粒的增加也導致類過敏反應發生率的上升[29]。

3.3 大分子物質才是影響雙黃連注射劑安全性的主要因素 綜上所述，小分子物質與蛋白質結合產生的完全抗原確實會導致類過敏反應的發生，但無證據表明小分子以半抗原形式存在，與機體內血清蛋白結合，形成復合物而致敏，對于小分子致敏性的研究，運用的方法也主要是集中于單體成分或僅注射劑成品的致敏性模型的體內外生物學研究[17，30]，目前的研究方法和手段較為單一，對于單體成分和注射劑成品間的內在關聯性和可溯源性不強，而雙黃連中的化學成分復雜，具有多靶點的復雜性，各成分間相互作用在體內的反應機制更是難以明確，如有研究通過HPLC過濾熱毒寧注射液，發現雖然綠原酸會導致過敏，但在未過濾的熱毒寧中檢測到明顯的致敏作用，而超濾的熱毒寧沒有表現出明顯的致敏作用，這表明綠原酸和隱綠原酸作為單獨的化合物和混合溶液中的一個組分的致敏作用存在顯著差異[31]，所以小分子致敏只是一種潛在性的因素。且中藥煎煮劑與雙黃連口服劑很少有過敏反應報道，若小分子物質可自發的變成半抗原，就意味著口服也會出現同樣的過敏反應，但實際上，通過口服雙黃連而導致的過敏反應少有發生，很可能是口服藥物時其中大分子物質受到消化道或受到首過效應的影響，變成了小分子，減弱了其致敏性，而靜脈注射并不會導致大分子物質的消除。綜上，大分子物質很可能是導致雙黃連注射液類過敏反應發生的主要原因。

4 雙黃連注射劑引起類過敏反應的可能機制

類過敏屬固有免疫范疇，且雙黃連注射液具有植物提取物特征，其類過敏反應很有可能由病原相關分子模式（PAMP）所激發，PAMP指某些病原體具有非特異性，高度保守且病原體生存和致病性必要的分子結構，可被固有免疫細胞的模式識別受體（PRR）所識別。雙黃連注射液中含有多種大分子物質，包括核酸、蛋白質、多糖、縮合鞣質等，且中藥藥材也可能存在細菌、真菌的感染，兩者的細胞壁和細胞成分均含有病原相關分子模式，目前市面上的中藥注射劑制備過程中并沒有將大分子去除的工藝，這些物質很可能作為雜質被帶入到中藥注射劑成品中。因此雙黃連引起的不良反應很可能是由固有免疫中的病原相關分子模式激發的。

4.1 雙黃連注射液病原相關分子模式中可能的信號通路 模式識別受體（PRR）是一類表達于固有免疫細胞表面，溶酶體，細胞質中可識別PAMP/DAMP的識別分子，與PAMP/DAMP結合后，可迅速激活效應細胞，產生快速的生物學反應。

Toll樣受體（TLRs）：TLRs可以識別病原微生物的高保守結構基序，如脂類，蛋白，核酸類的PAMP，也可識別炎癥或組織損傷時產生的DAMP，當TLR通過識別PAMP可以激活NF-kB等轉錄因子，引起多種細胞因子和趨化因子的合成和分泌，誘發炎癥反應并介導巨噬細胞和中性粒細胞向炎癥部位浸潤[32]。

甘露糖受體：主要表達于巨噬細胞表面，可識別并結合微生物細胞壁糖蛋白和糖脂組分中的末端甘露糖和巖藻糖殘基，由此而介導巨噬細胞的吞噬作用。

清道夫受體：主要表達于巨噬細胞表面，可識別氧化的低密度脂蛋白，革蘭氏陽性菌LTA，革蘭氏陰性菌LPS和完整的細菌PAMP。

NOD樣受體（NLR）：主要分布在細胞質中，由3個結構域構成，C端LRR可以識別并結合細胞質中PAMP和DAMP，中間NOD結構可促使NLR分子互相聚合，改變構型，N端效應結構域則向下游傳遞信號，一旦LRR識別受體，則會解除NOD結構域寡聚化的抑制，暴露出效應結構域，誘導下游復合物形成。一些NLR通過招募和激活炎性半胱氨酸蛋白酶進入炎癥小體來發揮作用，而另一些則通過其他途徑觸發炎癥，包括核因子-κB、絲裂原活化蛋白激酶和調節因子途徑[33-34]。

NLRP亞家族及炎癥小體：NLRP是NLR最大的亞家族，其中以NLRP3為代表，其主要表達于巨噬細胞、外周血白細胞中，受到核酸，細菌代謝物等不同的PAMP和DAMP刺激后，可通過PYD-PYD相互作用募集凋亡相關微粒蛋白（ASC）接頭分子，形成含有NLRP3，ASC，Cardinal和 caspase-1 的炎癥小體，ASC通過CARD-CARD相互作用募集產生caspase-1，裂解pro-IL-1β和pro-IL-18，產生炎性細胞因子IL-1β和IL-18[35]。目前已鑒定的炎癥小體為NLRP1炎癥小體，NLRP3炎癥小體，IPAF炎癥小體，AIM2炎癥小體，均含有ASC，caspase蛋白酶以及NLR家族蛋白或HIN200家族蛋白，并最終激活caspase-1，激活炎癥反應細胞因子。

RIG-I樣受體（RLR）家族：RLR存在于絕大多數的組織細胞中，可以識別細胞質內的RNA病毒，目前已知的RLR有視黃酸誘導基因Ⅰ（RIG-Ⅰ）、黑色素瘤分化相關抗原5、遺傳學和生理學試驗室蛋白2（LGP2），其中RIG-Ⅰ主要識別5＇端帶有三磷酸基團的RNA和短的dsRNA，MDA-5可識別較長的dsRNA病毒，而LGP2具有負向調節RIG-Ⅰ的功能，可以阻礙RIG-Ⅰ識別病毒。當RLR被病毒激活后，可通過下游信號級聯，從而誘導I型干擾素和促炎細胞因子的產生[36-37]。

DNA識別受體家族：這些受體在許多組織，淋巴細胞，巨噬細胞中都高度表達，DNA依賴的干擾素調節因子激活物（DAI）可以直接結合雙鏈DNA，誘導Ⅰ型干擾素的產生，但其與DNA的序列并無關系，且小于100 bp的DNA也幾乎沒有激活作用；黑色素瘤缺失因子2（AIM2）介導半胱氨酸蛋白酶-1對細胞質雙鏈DNA的激活，AIM2在胞漿中表達，隨著半胱氨酸蛋白酶-1的募集和激活會導致AIM2炎癥小體的形成，進而誘導促炎性細胞因子的分泌，DNA依賴性RNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）也可以介導胞質DNA的識別并誘導IFN-β，最終激活固有免疫應答，清除病毒[38]。

4.2 損傷的主要方式

4.2.1 直接刺激肥大細胞和嗜堿性粒細胞 肥大細胞與嗜堿性粒細胞細胞質內都含有大量的嗜堿性顆粒，受致敏原刺激后，釋放預儲存的介質，產生脫顆粒作用，釋放如組胺、蛋白酶等生物活性介質進入細胞外液，導致血管通透性增加、平滑肌收和黏液腺分泌增多等過敏樣癥狀。常見的是過敏反應是IgE介導的，而在非IgE依賴途徑中，補體片段C3a，細胞因子，病原體相關分子模式等都可直接刺激肥大細胞脫顆粒[39-40]，通過靜脈注射，在外周血液中循環的大分子變應原也可以直接激活血管周圍的肥大細胞，可迅速有效地引發過敏反應[41]。如有實驗證明，中藥注射液可通過直接刺激小鼠肥大細胞脫顆粒釋放內源性組胺，從而導致類過敏反應[42]。其作用途徑與IgE介導的“經典途徑”不同，并非通過傳統免疫性反應的受體FcεRⅠ啟動信號轉導，在肥大細胞的表面存在著多種受體，促使肥大細胞脫顆粒有2個至關重要的事件，一是胞質內鈣離子濃度的升高[43]，如另一個則是蛋白激酶C（PKC）的激活，大量的G蛋白偶聯受體存在于肥大細胞表面，非免疫性介導的致敏原能夠繞過傳統的受體直接激活G蛋白傳遞信號，引起肥大細胞的脫顆粒，在接受到不同的激活方式后肥大細胞會脫顆粒并釋放過敏介質或炎性因子，如近年來發現肥大細胞上有一種G蛋白偶聯受體（MRGPRX2）被非免疫性的致敏原激活后可引起肥大細胞內鈣離子濃度升高，進而導致肥大細胞的脫顆粒，通過抑制MRGPRX2激活，可減弱類過敏反應[44]，且對MRGPRX2基因敲除的肥大細胞模型及小鼠進行體內外的過敏試驗后，發現肥大細胞的脫顆粒能力明顯降低[45-46]。

4.2.2 激活補體系統途徑 補體是固有免疫中一類可溶性模式識別分子，廣泛參與機體抗微生物防御反應以及免疫調節，當補體被激活時，會產生酶促級聯反應，繼而產生大量活化的酶分子，過度激活可引起肥大細胞脫顆粒，產生炎癥介質，發生類過敏反應[47]。

補體的3條活化途徑：

（1）經典途徑：是抗原抗體復合物結合C1q所啟動的活化途徑，免疫復合物作為其主要激活物質，是適應性免疫應答的主要效應機制之一，類過敏反應較少涉及。

（2）旁路系統：不依賴于抗原抗體復合物，越過C1，C2，C4直接從C3開始激活完成一系列的級聯反應，B因子與病原微生物表面的C3b結合為C3bB，在D因子和備解素參與下，形成C3轉化酶（C3bBb或C3bBbP），并通過C3正反饋放大環路，產生更多C3轉化酶和 C3b，形成 C5轉化酶（C3bBbC3b或C3bnBb）。

（3）MBL途徑：由MBL通過糖識別區（CRD）識別病原微生物表面的糖結構，活化MBL相關絲氨酸蛋白酶-1，直接裂解C3形成C3轉換酶（C3bBb），參與并加強旁路途徑。MBL途徑和旁路途徑都是由病原微生物激活，這兩種途徑在雙黃連注射劑所導致的類過敏反應中可能起到關鍵的作用。

3條途徑的共同點在于最終形成C3轉換酶，釋放C3a，C5a過敏毒素。二者是具有炎癥介質作用的活性片段，可與肥大細胞或嗜堿性粒細胞表面的C3aR和C5aR結合，使細胞脫顆粒，發生類過敏反應。已有實驗證明通過抑制C3a，C5a可以明顯降低雙黃連類過敏反應程度[48]。

檢測指標：補體系統最終產生C5b-9可與玻璃連接蛋白形成無活性復合體SC5b-9，是補體系統3條途徑共同產物，可以直接測定其來觀察補體系統的激活情況，如有實驗表明生脈及參麥注射液可以激活補體系統，導致SC5b-9的含量升高[49-50]，并引發類過敏反應；不同的途徑中也有一些具有特征性的產物，補體因子C4d是補體經典途徑的產物，由C4裂解產生，可持久存在，是經典途徑的代表性指標；旁路途徑中，Bb由B因子裂解而來，是旁路途徑別于其余2條路徑的代表性指標，也有實驗表明人血清與吐溫80孵育，可使Bb因子釋放量增加，并推測類過敏可能與旁路途徑有關[51]。

4.2.3 凝血系統與激肽系統 血漿中的凝血系統，激肽系統，與補體系統具有共同的激活物，如脂多糖等可以激活凝血因子XII（FXII），進而活化凝血，激肽系統。

FXII可啟動內源性凝血級聯反應并產生纖維蛋白多肽和凝血酶，前者可引起血管通透性的增加及白細胞的趨化，后者可以識別肥大細胞表面的蛋白激酶受體-1，3，4激活信號轉導通路，促使肥大細胞釋放多種活性物質，FXII還可觸發促炎激肽釋放系統，導致血管擴張劑緩激肽的釋放，促使肥大細胞脫顆粒[52-53]。

對于凝血途徑和激肽系統，其代表性指標尚需深入研究，但可根據機體發生類過敏反應后纖溶蛋白及機體的異常變化來判斷其是否參與，如血液粘稠度[54]。

5 展望

中藥注射劑作為中醫藥與現代科技結合的產物，起效十分迅速，也便于貯存攜帶，具有很好的臨床應用價值，盡管目前會導致不良反應的發生，但不能因噎廢食，無論是從傳統中醫學的角度還是現代醫學的角度來看，去除雙黃連注射液中的邪氣，提高其安全性問題，才是首要問題。中藥注射液中具有多種大分子雜志，結合本課題組的前期研究[55]，通過分子篩技術將這些大分子去除，其主要療效并不會降低，且可以提高中藥注射劑的外觀質量及穩定性，在一定程度上提高其安全性，降低不良反應的發生[25]。并且我們推測雙黃連注射液所致的類過敏反應的機制，很有可能是因為其中的大分子雜質激活了人體的病原相關分子模式（PAMP）或損傷相關分子模式（DAMP）所致，目前尚需對此做出進一步的研究。