微小RNA——心血管疾病的新興要素

沐嘉馨 林 利

微小RNA(microRNA，miRNA)是一種內源性RNA，長度為19～25個核苷酸，可調節靶基因的轉錄，單個miRNA可以靶向數百個信使RNA(mRNA)，參與許多基因的表達并影響基因間的相互作用[1]。當前，已知的人類miRNA超過1000種，miRNA控制著哺乳動物50%以上的蛋白質編碼基因，在細胞動態平衡中起著至關重要的作用[2]。在心血管系統中，miRNA通過影響mRNA穩定性來調控蛋白質翻譯，進而影響細胞間通信，并控制著心肌細胞、內皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞的功能，這為心血管疾病在病理生理學方面提供了新的視角[3]。近年來多項研究表明，miRNA廣泛參與心血管疾病的發生、發展過程，并為疾病的治療帶來更多可能，miRNA已然成為心血管領域的熱點。

一、miRNA的形成和功能

miRNA是廣泛存在于細胞、組織和體液的短RNA分子，其可通過靶向mRNA的3′非翻譯區來介導靶基因的轉錄，并使基因沉默[1]。miRNA被 RNA 聚合酶Ⅱ轉錄為約有幾千個堿基的發夾狀結構的轉錄物pri-miRNA，在細胞核中，蛋白復合物Drosha和雙鏈RNA結合結構域蛋白DGCR8在發夾堿基附近切割pri-miRNA，對pri-miRNA進行加工，釋放出約70～90個核苷酸的帶有發夾形莖環結構的pre-miRNA；在細胞質中，雙鏈特異性核酸內切酶RNase Ⅲ(ds-RNAseⅢ)Dicer蛋白將pre-miRNA加工成一個22個核苷酸的雙鏈miRNA[4]。miRNA靶向mRNA的3′非翻譯區，將自身雙鏈當中的一條引導鏈整合到RNA誘導的沉默復合物中，以此介導基因沉默，隨后另一條稱為乘客鏈的單鏈降解[1]。

成熟的miRNA參與調控基因表達，miRNA序列可靶向其互補的mRNA，導致mRNA翻譯抑制，從而負向調節基因表。miRNA-mRNA相互作用機制的主要決定因素是miRNA與靶標之間的互補程度，miRNA與mRNA接近完美互補的情況下，可以切割和降解目標mRNA，miRNA與mRNA序列配對不完全的情況下，mRNA翻譯將受到抑制[5]。來自同一家族的miRNA簇基因可以潛在地調節細胞各項功能，包括生長、增殖、分化、發育、代謝、免疫、細胞死亡、細胞器生物發生、信號傳遞、DNA修復和自我更新等；miRNA簇也受到遺傳和表觀遺傳事件的調控，失調的miRNA簇是導致其他疾病發病機制的關鍵，包括神經系統疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病等[6]。miRNA不編碼蛋白質，但可以利用自身序列特異性控制翻譯，在細胞功能的調節和疾病的生理病理中起著重要作用，這種轉錄后調控基因的方式給醫學領域帶來新的思考方式和利用手段。

二、miRNA與心血管系統的發育

miRNA是一種豐富且穩定的小RNA類，它廣泛存在于人體中，其中心臟特異性miRNA在心臟發育、功能和病理中起著重要作用。miR-1和miR-133a是肌肉特異性miRNA，主要控制心臟形成的早期階段。miR-1和miR-133a參與多功能干細胞的早期發育，兩種miRNA的表達都促進多能干細胞中胚層的形成；但在心臟分化的過程中，miR-1和miR-133a表現出拮抗作用，miR-1促進心臟分化，而miR-133a降低心臟分化[7]。除miR-1和miR-133a參與誘導和維持心臟特異性的肌肉發育外，miR-208可調節心肌中主要的收縮蛋白肌球蛋白重鏈的表達，調控心肌細胞的終末分化，介導成纖維細胞向心肌細胞分化；miR-499與miR-208一樣調節晚期心臟分化，將成纖維細胞最終分化為心肌細胞[8]。Luo等[9]通過注射他莫昔芬破壞小鼠體內的Dicer蛋白，使成熟miRNA水平急劇下降，實驗過程中用超聲檢查發現，miRNA缺陷小鼠的左心室迅速擴張，心臟功能嚴重受損，且Dicer突變小鼠全部9周內死亡；而搶救性注射miR-1可以減緩Dicer缺陷小鼠的心力衰竭，抑制心臟肥大和纖維化。另有研究發現，在新生小鼠中，miR-128的心臟特異性過表達損害了心肌細胞(CM)的增殖和心臟再生，刪除miR-128會促進成年CM的細胞周期重新啟動，使它們進入增生狀態，增強CM可塑性[10]。

目前已經發現多種miRNA調控內皮細胞和平滑肌細胞的功能，并調節血管生成的各個階段。miR-126和miR-132是內皮特異性miRNA，miR-126的上調可激活血管內皮生長因子(VEGF)信號通路，抑制發芽相關蛋白1(SPRED1)，促進血管發育和血管發生；miR-132除發揮促生理性血管生成作用，也可下調p120Ras分子制動器(RasGAP)來促進病理性血管生成[11]。miR-143和miR-145為血管平滑肌細胞(VSMC)的關鍵調節劑，可調節VSMC增殖、遷移和凋亡，兩者協同增強VSMC收縮表型[12]。

三、miRNA在心血管疾病中的作用

1.miRNA與動脈粥樣硬化：動脈粥樣硬化是以脂質代謝障礙為病變基礎的動脈病變，可導致動脈壁增厚變硬，血管狹窄甚至阻塞，從而影響血管所供應的組織或者器官的血流，是冠心病、心肌梗死、腦梗死的主要原因。miRNA可調節動脈粥樣硬化基因并參與調節轉錄后基因的表達，影響內皮細胞、平滑肌細胞和白細胞的功能，調控動脈粥樣硬化斑塊的生長，在動脈粥樣硬化的病理生理中發揮作用，因此可利用miRNA作為新型療法，從而可能更好地管理血管疾病[13]。控制炎癥是動脈粥樣硬化治療的關鍵，載脂蛋白E(apoE)具有抗發炎特性，可預防動脈粥樣硬化和其他發炎性疾病，細胞中apoE的表達通過增強單核細胞和巨噬細胞中的miR-146a水平，來抑制核因子-κB介導的炎癥，減緩動脈粥樣硬化進程[14]。Huang等[15]通過將高膽固醇飲食喂養的Mir652-/-Apoe-/-(Mir652-/-)小鼠和Mir652+/+Apoe-/-(Mir652+/+)小鼠進行頸動脈損傷，來分析miR-652對內皮修復的影響，發現miR-652-3p抑制了內皮修復基因細胞周期蛋白D2(Ccnd2)的表達，導致Mir652+/+小鼠內皮修復緩慢，動脈粥樣硬化病變進程推快，而敲低miR-652有助于延緩動脈粥樣硬化。

氧化的低密度脂蛋白(ox-LDL)可促進內皮細胞損傷，推動動脈粥樣硬化的進程，也可導致內皮細胞自噬，在ox-LDL誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的自噬中，miR-155的表達上調，且miR-155對ox-LDL誘導的HUVEC自噬具有促進作用[16]。因此，miR-155可能通過增強內皮細胞的自噬抑制動脈粥樣硬化的發生、發展，為miR-155調控動脈粥樣硬化過程提供新思路。另一項研究發現，在oxLDL誘導人單核細胞(THP-1)建立的泡沫細胞模型中和動脈粥樣硬化患者的血漿和斑塊中miR-155的表達顯著升高，增加的miR-155可利用負反饋回路，抑制鈣調節的熱穩定蛋白1(CARHSP1)介導的腫瘤壞死因子α(TNF-α)刺激，由此減輕炎癥和泡沫細胞形成，延緩動脈粥樣硬化進程[17]。Zhang等[18]研究發現，miR-155的過表達可增強巨噬細胞中的膽固醇酯水解酶(CEH)信號轉導途徑，減少細胞內膽固醇酯(CE)的積累并增強游離膽固醇(FC)和膽固醇的外流，顯著抑制巨噬細胞向泡沫細胞的轉化，從而導致細胞內脂質的積累減少，抑制動脈粥樣硬化的形成。

2.miRNA與心肌梗死：心肌梗死是因冠狀動脈缺血、缺氧所引起的心肌壞死，其高發生率和病死率是威脅人類健康的主要原因。成人的心臟再生能力非常有限，壞死的心肌細胞被纖維化瘢痕所替代，接著周圍心肌開始重塑，最終可導致心臟功能受損，觸發心力衰竭。臨床上對心肌梗死的治療通常采用冠狀動脈介入術和血運重建術，這些手段可及時有效地緩解心肌梗死癥狀，疏通堵塞的血管，但也可能帶來一些并發癥，比如冠狀動脈破裂、血管閉塞、心肌穿孔、再灌注損傷等，更嚴重者會導致心臟永久性結構損傷，miRNA為心肌梗死提供一條不同傳統治療方案的新道路。Gabisonia等[19]研究發現，通過腺相關病毒載體遞送miRNA-199a到心肌梗死的動物體內1個月后，被治療的動物心肌的去分化和增殖能力提升，心臟在總體和局部收縮力方面均表現出明顯的改善，肌肉質量增加，瘢痕大小減少，證實miRNA-199a可以刺激心臟修復。

miR-21是心肌梗死病理生理中的重要調控分子，它參與心肌梗死和心臟纖維化的發病機制，在心肌梗死后的心臟重塑中起關鍵作用，也是心肌梗死的潛在診斷生物學標志物。Zhang等[20]通過對患有急性心肌梗死(AMI)和心絞痛(AP)的患者進行研究，用實時PCR測定血漿miR-21水平，發現與AP或健康人比較，AMI患者的血漿miR-21水平顯著升高，證實血漿miR-21可能是診斷AMI的新型生物學標志物。在梗死心臟的巨噬細胞富集區域提高miRNA-21轉錄水平，可以將巨噬細胞表型從促炎性轉變為修復性，促進血管生成，并減少遠端心肌的肥大，纖維化和細胞凋亡，從而促進炎癥消退并改善心臟愈合[21]。心臟富含多種特異性miRNA，這些miRNA療法對心肌梗死的治療有著巨大潛力。

3.miRNA與心力衰竭：心力衰竭是心排出量不足以滿足人體的代謝需求的復雜疾病，是心臟疾病發展的終末階段。miRNA參與了與心力衰竭有關的多種病理生理過程，miRNA能在循環中發揮積極作用，可作為心力衰竭的治療靶點，為治療心力衰竭提供有效策略。Xiao等[22]研究發現，miR-129-5p通過靶向高遷移率族蛋白B1(HMGB1)改善慢性心力衰竭大鼠的心臟功能，轉染miR-129-5p的心力衰竭模型大鼠的心臟功能和血流動力學參數得到改善，氧化應激和炎性因子減弱。Verjans等[23]發現，在伴有嚴重心肌纖維化的擴張型心肌病或主動脈瓣狹窄的的患者中，miRNA-221/222水平顯著降低，并利用血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)介導的壓力超負荷模型小鼠，證實miRNA-221/222的抑制會導致纖維化增加，繼而引發心肌僵硬，心臟舒張和收縮功能障礙，最終導致心力衰竭，其機制與miRNA-221/222靶向轉化生長因子-β(TGF-β)介導的信號轉導和下游基因表達有關。另有研究指出，miR-223可以顯著抑制含胱冬肽酶富集功能域的凋亡抑制因子(apoptosis repressor with CARD,ARC)的表達，從而誘導心肌肥厚和心臟衰竭，而心臟相關環狀RNA可消除miR-223對ARC表達的抑制作用，保護心臟免受心力衰竭的侵害[24]。

許多miRNA已顯示在心力衰竭中具有潛在的生物學標志物作用，對心力衰竭的診斷提供更多參考。有研究發現，與健康對照組和無心力衰竭的患者比較，急性心力衰竭患者的血漿miR-302家族成員水平升高，且miR-302水平與NT-proBNP(N末端B型利鈉肽原)水平呈正相關，并使用ROC曲線證實，循環中的miR-302s，特別是miR-302b-3p，似乎是診斷急性心力衰竭和區分疾病嚴重程度的新型生物學標志物[25]。Liu等[26]觀察發現，在7例健康對照組和9例C或D 期心力衰竭患者中，有7種miRNA差異表達，并進一步研究了這些miRNA，證實心力衰竭的循環標志物miR-197-5p與50歲以下心力衰竭患者的心肌纖維化和不良心臟事件相關。

4.miRNA與高血壓：高血壓是以體循環動脈血壓增高為主要特征(收縮壓≥140mmHg,舒張壓≥90mmHg,1mmHg=0.133kPa)的心血管疾病，是許多其他心血管疾病的危險因素，可發生嚴重的心臟、腦、腎臟等器官的損害和病變，比如腦卒中、冠狀動脈疾病、心力衰竭和慢性腎衰竭。miRNA被認為是高血壓的關鍵調節因子，其可介導高血壓基因表達調控以及調控靶點和信號通路，在高血壓的診斷和治療中具有廣闊的應用前景。血管僵硬在高血壓的發病機制中起關鍵作用，蛋白質復合物translin(TN)/trax(TX)為miRNA降解酶，TN/TX復合物的缺失可選擇性地增加主動脈miR-181b，阻止因攝入高鹽水引起的血管僵硬[27]。因此，干擾miRNA降解可能成為治療高血壓的一種有潛力的手段。Li等[28]研究發現，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導的VSMC表型轉化模型中HMGB1升高，miR-181b-5p顯著下調，并進一步證實miR-181b-5p是HMGB1的負調節劑，HMGB1調節平滑肌細胞的表型轉化，使其從收縮型轉向合成型，與血壓呈正相關，推動高血壓發展。miR-181b-5p 靶向 HMGB1，調節VSMC的表型轉化，參與高血壓中血管重塑，是治療高血壓的新途徑。另有研究發現，miR-21在高血壓及相關疾病(包括肺動脈高壓、心臟相關性高血壓和高血壓腎病等)中顯著上調，并參與了誘導高血壓的信號通路來推動高血壓和相關疾病，且miR-21水平與臨床收縮壓、臨床舒張壓、C反應蛋白(CRP)和頸動脈內膜中層厚度(CIMT)呈正相關，其是高血壓重要的預后/診斷標志物[29]。

5.miRNA與心律失常：miRNA參與心律失常的發病過程，是潛在的治療靶標，并可預測疾病的預后。在心肌中特異性表達的miRNA可調節與心臟電活動有關的各種離子通道和蛋白質，參與許多心肌病理情況下的心律失常的發生。心肌細胞間的連接縫隙通道由連接蛋白組成，是保障心臟電活動協調轉導的關鍵，連接蛋白43(Cx43)在心室和心房表達，Cx43失調將會導致心律失常。Jin等[30]使用螢光素酶活性測定法，驗證Cx43是miR-206的直接靶標，并建立miR-206過表達小鼠模型發現，miR-206直接識別Cx43 mRNA的3′-非翻譯區，下調心肌細胞中的Cx43水平，從而引起異常的心率和PR間隔，導致室性心律失常并縮短了實驗小鼠的壽命。鋅指同源盒3基因(ZFHX3)的功能喪失突變與心房顫動(AF)風險增加相關，Cheng等[31]用實時定量PCR分析ZFHX3敲低(KD)心房肌細胞和對照組細胞的miRNA，發現17種差異表達的miRNA，其中6種人類同源的miRNA中miR-133a和miR-133b顯著下調，并用遙測心電圖證實轉染miR-133a/b模擬物后逆轉了ZFHX3KD小鼠的房性心律失常。因此，增加miR-133水平可能是患有ZFHX3功能障礙的心房顫動患者的潛在治療方法。此外，Zhang等[32]通過實時PCR分析發現，復律成功的AF患者中復發患者與非復發患者比較，血漿miRNA-155明顯上調，并通過ROC曲線分析，證實血漿miRNA-155可預測心臟復律后的心房顫動復發。

四、展 望

miRNA有著復雜的調節網絡，一個miRNA可以有多個靶基因，而一個靶基因可受多個miRNA的調控。miRNA廣泛參與真核基因的表達，調控細胞分化、增殖和凋亡等過程，對疾病發生、發展和治療有著重要作用。miRNA在心血管領域發揮著不俗的作用，其調控心肌細胞、內皮細胞和血管平滑肌細胞等，影響心血管系統的發育，并參與心血管疾病的發生、發展。miRNA是潛在的心血管疾病的生物學標記，提供了新型的治療方案，并可預測心血管病的預后。但目前還面臨著許多問題，例如，如何有效、快速地模擬miRNA進行新藥研發，怎樣確保miRNA靶向藥物進行準確的靶向傳遞，以及如何避免miRNA脫靶刺激所帶來的各種不可預測的不良反應。目前miRNA尚處于研究起步階段，利用miRNA在臨床上解決心血管疾病還未到成熟階段，這需要科研人員深入開展miRNA與心血管疾病的研究。