骨性關節炎中軟骨細胞死亡方式的研究進展

姜思羽，許碧蓮，劉義

(廣東醫科大學a.藥理學教研室，b.廣東天然藥物研究與開發重點實驗室，c.海洋醫藥研究院，廣東 湛江 524023)

骨性關節炎(osteoarthritis，OA)是一種慢性進行性和退行性骨關節疾病，其發病年齡呈現低齡化趨勢[1]。OA的主要特征為：①關節軟骨的進行性退變；②骨贅的出現及形成；③滑膜炎癥的出現；④軟骨下骨增厚；⑤膝關節腔間隙變窄[2]。年齡增長、肥胖、應激性損傷、創傷和先天性關節異常等多種因素均可引起OA[3]。目前，廣泛采用的OA治療方法主要為使用非甾體抗炎藥緩解疼痛狀態以及關節置換術[4]。有文獻報道，OA的主要致病原因為軟骨細胞外基質的丟失和異常重建[5]。軟骨細胞作為關節軟骨中的唯一細胞類型，它們能對損傷做出反應，維持組織內穩態，并參與OA的軟骨重建過程。正常生理情況下，軟骨細胞的分化與凋亡、軟骨基質的合成和分解維持動態平衡，但當OA發生時，這種平衡被打破，導致軟骨基質降解，軟骨細胞過度凋亡，最終引起關節軟骨的退變[6]。現就OA中軟骨細胞死亡方式的相關進展予以綜述。

1 軟骨細胞凋亡

凋亡是細胞受環境刺激后，在基因調控下所產生的一種自然死亡現象，失去作用或已經受損的細胞會在胱天蛋白酶(caspase)誘導下啟動程序性自我毀滅過程，細胞凋亡屬于正常的細胞周期發育。凋亡發生時，細胞的生理特征表現為細胞皺縮且密度增加、染色質濃縮，進而細胞核裂解、細胞膜內陷形成凋亡小體。體內被膜包裹的囊泡被駐留的吞噬細胞迅速吞噬，從而避免細胞內的成分暴露于免疫系統誘發炎癥反應[7]。骨關節退行性病變伴隨軟骨細胞凋亡，被認為是OA發展的關鍵[8]。

1.1凋亡途徑 氧化應激、內質網應激和不適當的機械信號刺激可誘導軟骨細胞凋亡，誘發OA。基于上述三種刺激方式，細胞凋亡途徑分為死亡受體介導的途徑(即外源性途徑)和線粒體介導的途徑(即內源性途徑)[9]。其中，外源性途徑由損傷或病原體相關分子以及通過激活腫瘤壞死因子超家族受體的細胞因子誘導；內源性途徑則通過響應細胞內損傷，細胞因子皺縮，DNA損傷，氧化應激或內質網應激以及胞質內Ca2+超載而觸發[10]。雖然三種刺激方式激活的相關下游蛋白不同，但最終均通過激活caspase引起凋亡[11]。

1.2凋亡相關信號通路

1.2.1一氧化氮(nitric oxide，NO)信號通路 NO信號通路是OA軟骨細胞凋亡中的促凋亡通路。軟骨細胞有產生NO的能力，而NO在細胞增殖、分化甚至抵抗氧化應激方面發揮關鍵作用[12]。據報道，微量NO對軟骨細胞沒有細胞毒性，而過量NO抑制軟骨細胞基質合成并導致軟骨退化[13]。研究發現，關節炎患者關節滑液中能檢測到高水平的NO，證明NO與OA發展之間存在聯系[14]。實驗證明，體內NO主要通過其供體硝普鈉以內質網應激方式誘導軟骨細胞凋亡，內質網應激發生后，內質網應激相關凋亡分子同源蛋白、葡萄糖調節蛋白78在軟骨細胞中表達增加，從而促進軟骨細胞凋亡[15]。

1.2.2自殺相關因子(factor associated suicide,Fas)信號通路 Fas信號通路是OA軟骨細胞凋亡中的重要促凋亡通路。Fas受體屬于腫瘤壞死因子/神經生長因子受體家族，通過接收Fas配體、Fas抗體或兩者胞外部分脫落蛋白(可溶性配體)所傳導的信號介導細胞凋亡。在凋亡的外在途徑中，caspase-8為中心調節者。caspase-8被激活能引起caspase的斷裂以及下游caspase-3、caspase-6、caspase-7的激活，從而誘導凋亡，其中caspase-3是caspase-8下游的重要靶點。此外，Fas能與其配體結合，介導caspase-8誘導Fas陽性細胞死亡，從而促進軟骨細胞凋亡[16]。

1.2.3核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路 NF-κB參與多種細胞中的機體免疫、凋亡與分化、炎癥反應以及腫瘤生長抑制過程的信息傳遞，具有促進細胞凋亡與抑制細胞凋亡的雙向作用[17]。有文獻報道了NF-κB信號通路在OA發展以及軟骨細胞表型維持，基因蛋白表達，軟骨細胞機制合成與分解中的重要作用[18]。在OA中，激活NF-κB信號通路可促進軟骨細胞凋亡，從而促進OA發展。研究表明，miR-146a可以通過抑制腫瘤壞死因子受體相關因子6的表達和NF-κB信號通路的活化來促進OA軟骨細胞的增殖并抑制其凋亡，提示NF-κB信號通路的激活可促進軟骨細胞凋亡[18]。

1.2.4磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信號通路 PI3K/Akt信號通路是OA軟骨細胞凋亡中的重要抑制凋亡通路，當PI3K被細胞外信號刺激并激活時，Akt作為其靶點通過多種途徑抑制軟骨細胞凋亡：①直接磷酸化下游調節細胞凋亡的靶基因Bcl-xl，使其與抗凋亡因子Bcl-2解聚，抑制軟骨細胞凋亡。②直接磷酸化caspase-9，caspase-9失活后抑制下游caspase-3及caspase-7的活性，從而抑制軟骨細胞凋亡。③活化NF-κB，使其進入細胞核并抑制軟骨細胞凋亡[19]。

1.2.5Wnt/β聯蛋白信號通路 Wnt/β聯蛋白信號通路在涉及細胞增殖、分化、成熟以及凋亡的生物過程中起關鍵作用，研究證實其穩定性與細胞穩態以及關節組織的完整性有關[20]。DKK1(Dickkopf-1)是一種Wnt/β聯蛋白抑制劑，研究發現DKK1可以誘導OA軟骨細胞凋亡，而抑制DKK1能減少軟骨細胞凋亡，可見Wnt/β聯蛋白信號通路對軟骨細胞凋亡以及關節軟骨的破壞具有保護作用[21]。

1.2.6p38促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路 MAPK亞家族包括p38 MAPK、胞外信號調節激酶和c-Jun氨基端激酶。其中，p38 MAPK信號通路在軟骨組織穩態和發育中起重要作用，控制著軟骨細胞的分化、增殖，細胞因子的產生、衰老和凋亡[22]。白細胞介素-1和腫瘤壞死因子-α可以激活p38 MAPK途徑中的p38，通過一系列級聯反應抑制OA軟骨細胞凋亡及白細胞介素-1表達[23]。

1.3軟骨細胞凋亡與OA 研究發現，OA軟骨細胞凋亡的發生率遠高于正常軟骨細胞，發生凋亡的軟骨細胞數量與軟骨退化和(或)OA嚴重程度呈正相關[24]；另有研究發現，軟骨細胞凋亡可能是OA發生的先決條件，在人類軟骨中作為OA發生的起始步驟出現[25]。文獻報道，細胞凋亡取決于觀察到發生凋亡的軟骨細胞數量增加或正常軟骨細胞數量減少，甚至在相對正常的OA軟骨內，研究人員發現凋亡相關基因的表達出現變化[25]。因此，軟骨細胞凋亡既是調控OA發生的原因也是促進OA發展的結果，雖然軟骨細胞死亡發生在骨關節炎并與軟骨退化有關，但目前尚不清楚軟骨退化是在軟骨細胞死亡之前還是之后發生。

2 軟骨細胞的自噬性細胞死亡

自噬性細胞死亡是軟骨細胞的一種穩定機制，可以自我清除功能失調的細胞器和大分子，軟骨細胞能通過自噬性細胞死亡來維持營養和能量的穩態，從而保護細胞免受其應激狀態的影響[26]。雖然自噬不是一種細胞死亡，但它在調節細胞死亡和軟骨穩態方面起重要作用。研究發現，自噬與多種疾病(包括感染、衰老、癌癥、神經變性和OA)有密切關系[27]。然而，在某些特定條件下，細胞死亡也可由自噬誘導，這種由自噬引起的死亡被認為是區別于細胞凋亡(Ⅰ型程序性死亡)的另一種程序性細胞死亡(Ⅱ型程序性死亡)[28]。自噬性細胞死亡通過受到各種信號的刺激而發生，如低氧、內質網應激、能量平衡、細胞因子和生長因子。自噬性細胞死亡主要由哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路和Ⅰ類PI3K/Akt信號通路調控，其中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白與Ⅰ類PI3K均為自噬的負調節分子；同時，自噬性細胞死亡也可被氨基酸負性調節[29]。

軟骨細胞自噬發生在連續的步驟中，每一步均通過形成特定的多蛋白復合物來控制，在此過程中，回收目標組分逐漸被雙層膜包圍直至被捕獲在球形自噬體中。自噬溶酶體通過自噬體與溶酶體相互融合后產生，其中特定的溶酶體蛋白酶能夠消化回收目標組分，并釋放組分，然后被重新用于生物合成或作為能量來源[30]。

軟骨細胞中自噬的觸發旨在避免早期的OA軟骨細胞死亡。研究發現，缺氧誘導因子-1α和缺氧誘導因子-2α的增加介導了軟骨細胞對缺氧的反應，其中缺氧誘導因子-1α是自噬的正性調控因子，而缺氧誘導因子-2α是自噬的負性調控因子，缺氧誘導因子-2α在軟骨細胞中介導軟骨破壞及細胞死亡[31]。缺氧誘導因子-1α/缺氧誘導因子-2α是檢測軟骨細胞存活和(或)死亡的主要指標，它們能反映細胞死亡時傾向于自噬性細胞死亡或細胞凋亡[31]。文獻報道，軟骨細胞的自噬性細胞死亡與OA的發展密切相關[32]。雷帕霉素是一種有效的自噬誘導劑，對早期OA軟骨細胞增殖有促進作用，而過量的雷帕霉素導致OA軟骨細胞死亡；雷帕霉素誘導的自噬能消除白細胞介素-1產生的氧化應激，從而保護軟骨細胞[32]。因此，自噬可能通過促進軟骨細胞存活來保護關節軟骨[32]。在OA中，自噬雖是軟骨細胞生長的重要組成部分，但過量誘導自噬會導致軟骨細胞自噬性細胞死亡。

3 軟骨細胞的壞死性細胞死亡

壞死性細胞死亡主要定義為由有害刺激引起的被動、意外細胞死亡，如熱、紫外線輻射、缺氧和細胞毒性抗癌藥物。壞死性細胞死亡是細胞死亡的一種非編程、與caspase和能量無關的病理形式，是細胞暴露于高毒性物質或極端生理條件下發生的一種細胞死亡方式。因壞死性細胞死亡在形態學上常伴有細胞腫脹、線粒體腫脹及細胞質顆粒化，故會導致細胞質膜受損使其內容物不受控制的釋放入細胞內，從而產生炎癥反應[33]。

根據細胞死亡的不同形式及特點，細胞死亡模式被分為凋亡及壞死性細胞死亡兩種。其中，凋亡被認為是一種調控性的細胞死亡機制。隨著研究的不斷深入發現，壞死性細胞死亡也能作為程序性細胞死亡途徑影響軟骨細胞增殖與死亡，稱為“壞死性凋亡”。在分子水平上，壞死性凋亡是由許多信號通路相互作用引起，其中受體相互作用蛋白1激酶是一個中心啟動子[34]。研究發現，軟骨細胞中軟骨寡聚基質蛋白與假性軟骨發育不全相關的突變可誘導caspase依賴性壞死[35]。此外，文獻報道腫瘤壞死因子-α能通過壞死性凋亡誘導軟骨細胞死亡[36]。

4 凋亡、自噬性細胞死亡與壞死性細胞死亡的關系

研究發現，凋亡與自噬有密切聯系[37]。自噬是凋亡發生所必需的，通常發生在凋亡之前，且自噬也是細胞為了避免死亡而進行的一種保護機制。軟骨細胞凋亡可以被自噬性細胞死亡抑制，起保護軟骨細胞的作用，但一旦自噬被過度激活，線粒體中的前凋亡因子就會被激活，從而發生細胞死亡。此外，自噬與凋亡還可以相互轉化，從而共同促進細胞死亡。在某些條件下，當凋亡被抑制時，細胞會向自噬轉化[37]。

軟骨細胞凋亡與壞死性細胞死亡有關，兩者在組織學水平難以區分，因為這兩個過程可以獨立并連續的同時發生。此外，凋亡與壞死性細胞死亡具有共同的誘導物和生物化學網絡。通常可以從以下幾個方面判斷凋亡與壞死性細胞死亡：①細胞形態學變化。②細胞膜自身及其滲透性的改變。③寡核苷酸DNA片段化或允許DNA鏈斷裂檢測的末端脫氧核苷酸轉移酶生物素-脫氧尿苷三磷酸缺口末端標記技術。④caspase活化劑和(或)抑制劑的分析。⑤通過線粒體膜電位確定。在通路方面，凋亡與壞死性細胞死亡存在許多共同點，很多能誘導凋亡發生的因素，也可以導致壞死性細胞死亡[37]。

壞死性細胞死亡與自噬之間存在一定聯系。當一些促死亡因素被自噬清除時，有利于抑制壞死性細胞死亡。同時，在某些情況下，細胞發生壞死性細胞死亡的必要條件是自噬性細胞死亡的發生[38]。

5 小 結

軟骨細胞死亡的方式包括凋亡、自噬性細胞死亡和壞死性細胞死亡。它們與關節軟骨的退化及OA的發生和發展均有關。目前，凋亡、自噬性細胞死亡和壞死性細胞死亡的生物化學調控機制以及三者相互作用的具體機制尚不清楚。未來，進一步深入研究它們的生物化學機制，探明它們在OA中的作用，不僅有利于加深對細胞死亡方式的理解和認識，且對選擇OA治療靶點以及研究出更高效的OA治療藥物具有重要意義。