長鏈非編碼RNA在血管平滑肌細胞中的研究進展

謝中杰，袁曉晨，龔開政

(揚州大學附屬醫院心血管內科，江蘇 揚州 225000)

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)是構成血管壁組織結構和維持血管張力的主要細胞成分，其生物學行為的改變(如表型轉換、各種原因引起的增殖、凋亡)是高血壓、動脈粥樣硬化、經皮冠狀動脈介入治療術后再狹窄等血管重塑性疾病的細胞病理學基礎，病理性刺激可誘導具有收縮功能的分化型轉變為具有增殖和遷移能力的去分化型，成人血管內的VSMC以極低的速率增殖，且合成活性較低[1-2]。早期對VSMC的研究集中于許多蛋白質信號通路，包括經典的G蛋白偶聯受體和受體酪氨酸激酶參與的調節VSMC對環境刺激和生長因子的反應。近年來，許多非蛋白質機制和轉錄后機制[如非編碼單鏈RNA即微RNA(microRNA，miRNA)和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)介導的機制]在VSMC中發揮作用[3]。非編碼RNA一直處于研究的最前沿，參與正常細胞過程、疾病狀態下的功能失調。通過對lncRNA進行研究可以為VSMC的作用以及可能的相關調控機制提供新的見解?，F對lncRNA與VSMC研究的最新進展進行綜述。

1 lncRNA概述

1.1lncRNA的概念 lncRNA是指長度大于200個核苷酸且通常不編碼蛋白質的DNA轉錄產物，根據染色體上與編碼基因的相對位置將lncRNA分為正義、反義、雙向、基因間、基因內五種類型，lncRNA在不同組織間表達量不同，在同一組織不同生長階段也存在差異，與蛋白質編碼基因相比，lncRNA能顯示出更多的組織特異性，在lncRNA發現早期，人們認為lncRNA并不具有生物學功能，是RNA聚合酶Ⅱ轉錄的副產物，后來發現lncRNA在基因表達調控和維持正常細胞功能方面具有重要生物學功能[4-5]。

lncRNA可以通過表觀遺傳、轉錄和轉錄后的功能機制調節基因表達，通常根據其細胞定位調節眾多細胞生長過程而發揮強大的生物學調節功能，如定位于細胞核中的lncRNA可通過引導或隔離轉錄因子、誘導組蛋白修飾、將染色質重塑復合物引導至正確的染色體位置或充當增強子RNA來調節轉錄[6]。在細胞質中，lncRNA可以作為miRNA海綿或充當蛋白質復合物的“支架”調節mRNA穩定性并控制翻譯過程，還可參與蛋白質磷酸化和信號轉導通路的激活。此外，一些lncRNA可在外泌體或微囊泡中釋放，促進細胞間通訊。

1.2lncRNA與平滑肌細胞表型轉化 平滑肌細胞從收縮表型向合成表型轉化的過程稱為表型轉化，表型轉化是冠心病、冠狀動脈支架術后再狹窄、腦卒中、動脈瘤等血管疾病發生和發展的重要步驟[7]。肺腺癌轉移相關轉錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)已被確立為體內血管生成的重要調節劑，一項胸主動脈瘤相關平滑肌細胞功能的研究發現，MALAT1可與組蛋白去乙?；?和染色質重塑酶Brahma相關基因1的免疫沉淀物結合，MALAT1表達的沉默可抑制該免疫沉淀物的穩定性，從而降低基質金屬蛋白酶-2和基質金屬蛋白酶-9的活性，下調增殖相關標志物的表達，如增殖細胞核抗原、細胞周期蛋白D1和骨橋蛋白基因，促使平滑肌細胞從合成表型轉化為收縮表型，且細胞周期停滯在G2期[8]。

心肌素蛋白是血清應答因子的轉錄共激活因子，通過與血清應答因子結合形成復合物，激活順式作用元件CArG盒依賴的平滑肌特異性基因(如α-平滑肌肌動蛋白的活性)，從而調節平滑肌細胞的表型轉化[9]。MYOSLID(MYOcardin-induced Smooth muscle Long non-coding RNA)是一種VSMC特異性表達的lncRNA，是心肌素蛋白/血清應答因子和轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路的直接轉錄靶標，可促進纖維型肌動蛋白的組裝，通過心肌相關轉錄因子A核轉位和下游VSMC收縮基因的轉錄激活，進而穩定VSMC的收縮表型[10]。

lncRNA核富含豐富的轉錄本1(nuclear-enriched abundant transcript 1,NEAT1)由人第11號染色體MEN1基因位點轉錄而來，已被證實在多個腫瘤發生發展中起關鍵作用。Paraspeckles是一種位于哺乳動物細胞染色體間區、由NEAT1與多種RNA結合蛋白構成的新型細胞核亞結構小體，Wang等[11]發現，NEAT1在響應來源于線粒體損傷的信號時通過增強Paraspeckles對細胞核內轉錄的具有調控線粒體功能的信使RNA的核滯留以反饋調節線粒體相應的生理過程，影響線粒體形態、耗氧速率、ATP合成能力，導致線粒體功能紊亂，最終影響平滑肌細胞的增殖速率。Ahmed等[12]進一步研究發現，NEAT1可通過結合表觀遺傳活化劑WDR5(WD repeat-containing protein 5)蛋白而阻斷組蛋白甲基轉移酶1與WDR5相互作用，從而調控組蛋白甲基轉移酶1催化功能，減少血清應答因子與平滑肌特異性基因啟動子內的CArG盒的結合，抑制平滑肌收縮相關蛋白表達進而促進平滑肌細胞增殖和遷移。

Bell等[13]對人冠狀動脈VSMC進行RNA測序，發現SENCR(Smooth muscle and Endothelial cell enriched migration/differentiation-associated long Non-Coding RNA)是一種新型細胞質定位的lncRNA，降低SENCR表達可導致心肌素及平滑肌收縮相關的基因表達下調，且許多遷移相關的基因表達升高，可穩定平滑肌細胞收縮表型；進一步研究發現SENCR可響應于層流剪切應力變化，其通過與細胞骨架相關膜蛋白4的物理結合促進內皮細胞黏著連接完整性，對于維持血管內皮的完整同樣具有重要作用[14]。

1.3lncRNA作為競爭性內源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)調控平滑肌細胞 miRNA是20～25個核苷酸的非編碼RNA，其基于對靶基因信使RNA 3′非翻譯區的序列特異性調節其穩定性、翻譯過程，既往研究發現miRNA的異常水平與多種疾病相關[15]，ceRNA假說支持lncRNA可通過隔離miRNA活性，從而上調miRNA靶基因表達[16]。MALAT1作為ceRNA通過結合miR-142-3p調節細胞自噬相關基因的表達，減弱人血小板衍生生長因子BB誘導的平滑肌細胞增殖和遷移[17]。Lin等[18]在研究高糖對VSMC鈣化、衰老的影響時發現，lncRNA-ES3與miR-34c-5p結合，作為miR-34c-5p的ceRNA，增強miR-34c-5p的靶基因BMF(Bcl-2的修飾因子)的表達調控VSMC凋亡。Wang等[19]發現母系表達基因3在氧化型低密度脂蛋白處理的VSMC中下調并與miR-361-5p呈負相關，可作為miR-361-5p的內源性海綿調節高密度脂蛋白轉運相關基因ABCA1表達，進而抑制VSMC的增殖和凋亡。ceRNA假說的提出對于預測未知功能的lncRNA具有重要意義。

1.4lncRNA參與調控的信號通路 lncRNA作用機制比較復雜，能與信使RNA、DNA及蛋白質相互作用，參與調節VSMC對環境刺激和生長因子的反應，在多種信號通路中發揮作用。生長阻滯特異性轉錄因子5(growth arrest-special transcript 5,GAS5)是通過消減雜交篩選出的lncRNA，在某些環境因素影響下(如營養匱乏、低氧誘導)，可競爭性抑制激活型糖皮質激素受體與靶基因結合，切斷糖皮質激素信號通路的轉導，進而導致平滑肌細胞生長停滯甚至凋亡[20]。有研究表明，lncRNA-GAS5還與高血壓血管重塑有關，GAS5可通過Wnt/β聯蛋白信號通路轉導調節VSMC功能[21]；另外，GAS5還可通過多個Smad結合元件競爭性結合Smad3蛋白，作為分子誘餌負向調節TGF-β/Smad3信號通路，從而抑制TGF-β誘導的VSMC分化[22]。

1999年首次發現了類固醇激素受體RNA激活劑(steroid receptor RNA activator，SRA)，SRA作為RNA存在能共激活多個類固醇激素受體[23]。Zhang等[24]通過構建股動脈損傷小鼠模型發現，過表達lncRNA-SRA可以通過促進VSMC增殖和遷移促進損傷后新內膜增生，生物信息學預測lncRNA-SRA與cAMP應答元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)相互作用。另有研究發現CREB可通過增強環腺苷酸信號轉導在VSMC中發揮促有絲分裂特性，且VSMC增殖與CREB激活有關，隨后實驗證實lncRNA-SRA還可通過激活分裂原活化抑制劑和胞外信號調節激酶磷酸化激活促分裂原活化的蛋白激酶信號通路轉導，進而導致磷酸化的CREB增加[25]。

p53是參與細胞增殖和凋亡的腫瘤抑制基因，在動脈粥樣硬化進展中也起重要作用。Wu等[26]發現lncRNA-p21的表達在ApoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化斑塊中顯著下調，可參與p53依賴性靶基因表達的調節而不改變p53本身的表達水平，可直接與E3泛素連接酶MDM2相結合，導致p53從MDM2釋放并與組蛋白乙?；竝300結合，反饋增強p53的轉錄活性，促進VSMC增殖，調節損傷誘導的新生內膜形成。

2 lncRNA與VSMC相關血管疾病

2.1lncRNA與動脈粥樣硬化 通常情況下，血管中膜的平滑肌細胞可以維持血管張力及結構的完整性，當血管內皮細胞受損時，平滑肌細胞會發生表型轉換，遷移到損傷的血管內膜，發生增殖異常及分泌大量細胞外基質，參與動脈粥樣硬化早期纖維帽的形成；晚期VSMC遷移能力增加，是不穩定性斑塊破裂、繼發出血和形成血栓的主要原因之一。在關于lncRNA的早期研究中，Ballantyne等[27]通過白細胞介素-1α和血小板衍生生長因子處理人大隱靜脈來源的VSMC，通過RNA測序的方法尋找差異表達的lncRNA，將lncRNA RP11-94A24.1高表達，命名為SMILR，與刺激呈時間依賴性表達增加，后聯合正電子發射計算機斷層成像在不穩定動脈粥樣硬化斑塊患者中得以驗證，證實了與動脈粥樣硬化之間的相關性。

心肌梗死是環境與遺傳因素共同導致的多基因遺傳病，全基因組關聯研究發現染色體9p21上單核苷酸多態性增加動脈粥樣硬化和心肌梗死的風險[28]。在染色體9p21.3位點附近存在CDKN2A/B抑癌基因，編碼蛋白p16INK4a、p14ARF和p15INK4b。Motterle等[29]發現rs1333048、rs1333049位點促進VSMC增殖并減少p16INK4a和p15INK4b的表達，9p21區域上風險等位基因與冠心病風險增加之間的關聯部分歸因于VSMC的增殖。INK4基因座中反義非編碼RNA(antisense non-coding RNA in the INK4 locus,ANRIL)是CDKN2A/B基因叢轉錄的一種lncRNA，一些風險單核苷酸的多態性會增加動脈粥樣硬化斑塊和外周血中ANRIL轉錄物的表達，且與動脈粥樣硬化的嚴重程度呈正相關[30]；多梳家族蛋白是一組參與轉錄基因抑制的蛋白，具有多梳抑制性復合物1/2兩種多蛋白復合物形式，多梳抑制性復合物1能通過單泛素化組蛋白H2A參與靶基因沉默的維持，多梳抑制性復合物2能通過催化K27H3的甲基化參與基因沉默的啟動，ANRIL能特異的結合多梳抑制性復合物2亞基和多梳抑制性復合物1亞基并調控CDKN2A/B位點的組蛋白修飾，促進異染色質形成，用作動態調節轉錄活性的分子支架，啟動并維持CDKN2A/B位點的基因沉默，最終影響平滑肌細胞增殖[31]。lncRNA ANRIL已顯示出對VSMC增殖的強大調節功能，可以作為動脈粥樣硬化的潛在生物標志物和治療靶標。

視網膜非編碼RNA3(retinal non-coding RNA3，RNCR3)最初被認為在小鼠視網膜發育期間表達，Shan等[32]發現在高脂飲食ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型中lncRNA-RNCR3也顯著表達，實驗證實RNCR3敲低加重了高脂血癥及炎癥因子的釋放，減少了小鼠堿燒傷誘導的角膜新血管生成，降低了胸主動脈的VSMC增殖、遷移能力，表明RNCR3可能在動脈粥樣硬化中發揮保護作用，進一步研究發現lncRNA-RNCR3還可在內皮細胞中通過競爭性結合miR-185-5p上調轉錄因子Krüppel樣因子2的水平，使內皮細胞表達和分泌的RNCR3可以包裝到外泌體中傳遞給平滑肌細胞從而發揮作用。

2.2lncRNA與血管緊張素Ⅱ(angiotensin，AngⅡ)及高血壓 Ang Ⅱ 是一種小多肽激素，VSMC上有血管緊張素受體，已成為原發性和繼發性高血壓分型診斷、治療、研究的重要指標。Leung等[33]研究Ang Ⅱ 相關的lncRNA發現，lnc-Ang362競爭性結合miR-221和miR-222。既往研究表明miR-221和miR-222可與細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子p57Kip2和p27Kip1基因結合，負責AngⅡ誘導的VSMC增殖，證實lnc-Ang362是AngⅡ相關心血管疾病的治療靶點[34]。

一項比較高血壓患者和健康對照人群lncRNAs差異表達的研究發現，高血壓患者血漿中lncRNA-AK098656顯著上升，進一步研究發現AK098656可與肌球蛋白重鏈11、纖連蛋白FN1的必需成分結合，誘導VSMC合成表型，并促進兩者通過蛋白酶體介導降解，進而在細胞質中充當核酸骨架的作用，最后還通過構建AK098656轉基因大鼠模型加以驗證[35]。

2.3lncRNA與腹主動脈瘤 VSMC表型轉變和凋亡、管壁中彈性蛋白和膠原的降解、T淋巴細胞的積累和新血管形成是動脈瘤疾病發生發展的關鍵過程。Li等[36]通過Ang Ⅱ /ApoE-/-小鼠腹主動脈瘤模型發現lncRNA H19高表達，利用位點特異性反義寡核苷酸敲低H19可顯著限制小鼠模型中動脈瘤生長，在細胞核中，H19可與缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)α亞基啟動子區域結合并招募轉錄因子Sp1，增強HIF-1α的表達；另外，H19的二級結構可以結合HIF-1α蛋白將其保留在細胞質中，細胞質內增加的HIF-1α直接與MDM2蛋白相互作用參與p53信號通路引發的平滑肌細胞凋亡，加速了腹主動脈瘤的發生?；蜷glncRNA-PVT1為人類漿細胞瘤多樣異位基因1(plasmacytoma variant translocation gene 1，PVT1)的轉錄產物，Zhang等[37]發現lncRNA-PVT1在腹主動脈瘤患者組織樣本中高表達，敲減PVT1治療可以通過減少VSMC凋亡、細胞外基質破壞和促炎細胞因子的表達，抑制AngⅡ誘導的腹主動脈進行性擴張。

3 小 結

非編碼RNA的發現是生命科學的重大突破，除參與各種生物過程外，非編碼RNA在疾病診斷和治療方面的潛力得到認可，血漿lncRNA H19已被認為是胃癌的生物標志物[38]。Amodio等[39]通過在體動物實驗證實GapmeR靶向MALAT1能夠降低多發性骨髓瘤活動性，突出了靶向lncRNA的治療潛力。Abudayyeh等[40]證實CRISPR/Cas13a技術能夠在哺乳動物細胞中編輯特定的RNA，達到RNA干擾相似效率，有更強特異性，且對細胞內天然的轉錄后調控網絡的影響更小。美國食品藥品管理局及歐盟委員會批準ONPATTROTM(Patisiran)用于遺傳性轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性成人患者[41]，治療其第一階段或第二階段多發性神經病變，可沉默遺傳性轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性相關信使RNA的表達，減少周圍神經中淀粉樣物質的沉積，成功實現干擾小RNA分子治療疾病的臨床轉化。lncRNA能夠調節VSMC的增殖、遷移和基質合成且均參與病變形成，盡管最近取得了一些進展，但大多數在調節VSMC表型轉換中發揮重要功能的lncRNA仍有待鑒定。