骨髓間充質干細胞治療骨質疏松性骨折的機制

楊顯紅，齊新文，李松軍

(遵義醫科大學第五附屬(珠海)醫院骨二科，廣東 珠海 519100)

骨質疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)是骨組織發生實質結構疏松、骨脆性增加等病理生理改變后，在低能量甚至無暴力情況下發生的一種病理性骨折，以高發病率(13%)、高致殘率、高致死率的特征嚴重危害人類健康，成為繼心血管疾病、糖尿病之后的第三大慢性疾病[1]。流行病學調查顯示，我國部分地區OPF患病率高達55.8%，成為全球OPF發病率最高的國家，是老年患者致殘和致死的主要病因[2-4]。目前臨床上治療OPF主要以手術內固定為主，但骨實質結構疏松易導致骨折延遲愈合，甚至不愈合，顯著增加了再骨折的發生風險[5]。因此，尋找有效的治療方向和措施對OPF有重要的研究意義。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是存在于機體結締組織和間質中具有多向分化潛能的一種干細胞，BMSCs數量減少或生物學活性下降可減弱成骨細胞的增殖能力，使骨小梁生成減少，引起骨組織動態重建失衡，骨實質微結構稀疏，最終發生OPF[6]。另一方面，在OPF發生時，BMSCs可通過細胞分泌、免疫調節、基因調節、信號通路等多種作用機制促進受損骨組織生成新骨，同時還可提高局部血管的再生能力，為骨組織重建提供良好的微環境。可見，維持BMSCs的正常生物學活性與OPF的疾病治療之間有著密切的聯系。現就BMSCs治療OPF的機制予以綜述。

1 BMSCs概述

BMSCs于軸骨或外周骨松質骨(海綿狀)的骨小梁中生成，在體內、體外多種不同的誘導條件下可進一步分化為胰腺細胞(內胚層)、成骨細胞和軟骨細胞(中胚層的)以及神經細胞(外胚層)等多胚層細胞，與機體多系統功能的維持有重要的聯系。研究顯示，BMSCs在骨髓組織中表達最豐富，但含量很少，且與年齡的增長呈負相關；同時，體外實驗研究證實，可通過控制細胞的培養條件，致使BMSCs作為“種子細胞”被定向誘導分化為特定的功能目的細胞，到達特定部位，完成歸巢，從而發揮特有的生物學活性作用；且BMSCs可多途徑獲得，具有標本取材方便、體外增殖能力強、細胞順應性高、免疫排斥反應弱等優點，經局部微環境移植到宿主后對激素性、糖尿病性、代謝性、老年性等多種OPF均有一定的療效[7-8]。近年來，BMSCs的移植治療機制、途徑、劑量等成為骨折治療的研究熱點。

2 BMSCs治療OPF的相關機制

2.1BMSCs歸巢 BMSCs歸巢是OPF治療機制的重要環節，OPF發生時，BMSCs在機體各種機制的協同作用下進入血液循環，與受損骨組織中被激活的血管內皮細胞進行高速“滾動”接觸，并且在局部炎癥因子、免疫調節因子、趨化因子等多細胞因子刺激下發生卷曲形變，隨即粘連附著在血管內皮細胞上，與G蛋白偶聯因子、整合素等跨膜受體相結合激活后，可穿跨細胞膜，進入骨髓龕位微環境；緊接著，在白細胞介素-1、炎癥趨化因子、轉化生長因子-β等各種細胞因子的介導下，與骨折處血管內皮細胞上的“地址素細胞黏附分子”靶向結合，發生定向遷移和分化，最終實現BMSCs到達OPF病變部位，從而發揮生物學活性的歸巢和植入過程；由此可見，在血管內皮細胞上的滾動過程是BMSCs歸巢的第一步，研究BMSCs歸巢機制有十分重要的意義[9-10]。

但是BMSCs自身缺乏血管內皮細胞的緊密結合能力，移植到動物體內骨折處5～8 d后，在骨折區才有微弱的熒光信號，代表了少數BMSCs完成歸巢移植過程，且該信號持續1～3 d后消失[11]。因此，提高BMSCs移植歸巢率對治療OPF有十分重要的作用。BMSCs表面能夠表達多種整合素分子，可促進BMSCs的附著歸巢過程。試驗顯示，在P-選擇素基因缺失或體內呈現中和抗體的P-選擇素元件時，人BMSCs與人臍帶靜脈內皮細胞滾動結合的發生率會顯著降低[12-13]。另外，Xiao和Chen[14]研究發現，表達含有N-連接唾液乳糖胺的CD44糖原變異體使用α-(1，3)-巖藻糖基轉移酶vi修飾后，產生E-/L-選擇素配體，誘導兔BMSCs巖藻糖基化，在注射BMSCs移植6周后檢查發現，小鼠的歸巢能力顯著增強。侯費祎等[15]將4′,6-二脒基-2-苯基吲哚標記的BMSCs靜脈注射于顱骨缺損的大鼠體內，同時予麝香酮灌胃干預后發現，麝香酮可顯著增加骨組織缺損處的BMSCs數量，并呈濃度依賴性，提示麝香酮可促進BMSCs在大鼠體內的歸巢。由此表明，增加特定選擇素、整合素等基因和蛋白的表達，降低體內相關抗體蛋白的分泌或進行必要的蛋白“修飾”細胞后，可能會有效提高BMSCs與血管內皮細胞的結合率和歸巢率。越來越多的研究人員試圖用基因轉染修飾工程來解決這些問題。Wang等[16]研究發現，紅色熒光蛋白轉染的BMSCs更容易定位于骨折部位，且股骨的力學性能得到顯著改善。

2.2細胞分泌 細胞因子在細胞增殖、分化、胚胎發育、細胞外基質形成、骨的形成和重建等方面起著不可或缺的作用。BMSCs完成滾動接觸、附著、遷移和分化等過程需要一個可以保持自我更新和多向分化潛能的良好微環境。在特定微環境下，BMSCs自身可以表達很多細胞因子，并促進一系列細胞因子釋放，通過自分泌及旁分泌的途徑促進成骨細胞不斷增殖分化。Lu 等[17]發現，腫瘤壞死因子-α增強核因子、胞外信號調節激酶活化后，呈劑量依賴性地提高血管細胞黏附分子1的表達水平，促進人臍帶BMSCs緊密黏附于靜脈內皮細胞。而轉化生長因子和骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)在成骨及成軟骨方面起著重要作用，常曉朋等[18]研究顯示，經慢病毒包裝的重組質粒轉染后的BMSCs、BMP-2及轉化生長因子-β2的表達水平顯著升高。同時，在微環境的形成過程中，還有其他細胞因子的參與。于佳等[19]研究表明，在卵巢早衰模型大鼠體內注射BMSCs后15 d，大鼠體內胰島素樣生長因子1受體核酸和蛋白表達水平均顯著升高，與空白對照組相比，可顯著促進局部骨折愈合及恢復。另一方面，當BMSCs 凋亡或代謝后不再駐留時，仍然可以通過損傷組織周圍被激活的干細胞，激活和啟動宿主自身的再生過程，繼續修復受損組織[20]，這一作用的相關機制目前仍未明確。近年來，越來越多的研究關注BMSCs的“營養”生物學活性在組織再生過程中的作用。BMSCs移植后，損傷組織分泌可溶性細胞外基質糖蛋白以及一系列的營養因子，通過“細胞-細胞”直接接觸的形式介導BMSCs和受損組織相鄰細胞緊密接觸，激活損傷周圍的干細胞，參與到骨折愈合的過程，并且在急性損傷期，BMSCs可能主要通過其“營養功能”促進組織再生[21]。由此可見，移植至宿體的BMSCs的分泌功能及其對自身干細胞的激活功能在OPF治療中也發揮著重要的作用，研究具體的分泌機制可能會帶來新的突破口。

2.3BMSCs治療骨折的相關信號通路 骨折發生時局部多細胞因子可通過激活相關信號轉導途徑而發揮生物學活性。Wnt信號通路是目前骨代謝相關疾病的研究熱點，當條件性剔除破骨細胞中的β聯蛋白基因時，會顯著降低骨量，而條件性激活β聯蛋白的表達后，則出現了骨量增多，表明Wnt/β聯蛋白信號通路的激活可促進成骨生成，抑制骨吸收，從而促進骨折愈合[22]。相反，Yuan等[23]的實驗研究表明，過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPAR)γ是BMSCs向成骨細胞分化過程中不可或缺的轉錄雙系調節因子，PPARγ表達減少可增強BMSCs成骨分化作用，抑制軟骨分化，表明抑制PPAR信號途徑的進一步激活可促進骨折的愈合。研究顯示，CXC趨化因子受體[chemokine(C-X-C motif) receptor，CXCR]陽性細胞可以通過骨髓釋放遷移到受損組織外周血中，且在基質細胞衍生因子趨化作用下表現為濃度升高，而加入中和抗體CXCR后，BMSCs的遷移率降至48%，表明通過激活CXCR/基質細胞衍生因子信號途徑可促進遷移和歸巢[24]。另外，多信號通路之間也有相互促進-抑制作用，從而在骨折治療過程中聯合發揮不同的生物學活性作用。Yuan等[23]的動物體內實驗顯示，激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號途徑可同時有效抑制PPAR信號轉導通路的激活，最終加速骨折的愈合進程。研究不同信號途徑在骨折愈合過程中的正負向、上下游相關關系及其發揮作用的具體位點，有利于研究藥物治療骨折的結合靶位點及具體機制。

2.4免疫調節 當干細胞進入人體后，可減輕宿主-細胞的免疫相互反應，會更加有效地發揮BMSCs的功能。BMSCs不表達CD80、CD86和CD40，進一步抑制單核細胞和CD34+造血祖細胞分化，不能激活宿主淋巴細胞[25-28]；通過蛋白切割作用抑制自然殺傷細胞p30和g2d基因的表達，抑制自然殺傷細胞活化，從而在體內體現為低免疫原性的優點，且該特點不隨著BMSCs的分化而顯著改變，但會誘導免疫耐受[29]。研究證實，當BMSCs和自然殺傷細胞在體外共培養時，可有效抑制自然殺傷細胞活化、干擾素的產生及細胞毒性作用；當BMSCs與抗原特異性T細胞共同孵育時，也能抑制抗原特異性T細胞的增殖和細胞毒性作用[30]。

2.5基因調節 細胞分化受多種細胞因子、轉錄因子、信號轉導通路和微RNA(microRNA，miRNA)的調節控制，miRNA可間接或靶點直接調節細胞因子活性、信號通路等環節，實現針對性治療。目前逐漸開展miRNA在OPF方面的研究，但具體機制仍未明確，且研究較少。miRNA是一種小的非編碼RNA，能抑制轉錄后基因的表達或降解其靶點。孫毅等[31]研究顯示，利用小鼠BMSCs與miR-187-5p基因轉染，過表達 miR-187-5p可提高堿性磷酸酶、膠原纖維蛋白-1、BMP-4、骨鈣素和骨橋蛋白等成骨分化相關基因核酸的表達水平，促進BMSCs向成骨分化；而敲低miR-187-5p基因可顯著降低堿性磷酸酶等成骨分化相關基因核酸的轉錄后表達，抑制BMSCs向成骨細胞的分化增殖。

3 BMSCs移植治療OPF的可行性

BMSCs數量的減少或功能的缺損可直接引起骨質疏松，容易進一步導致OPF。因此，系統或局部移植正常功能的BMSCs對治療OPF具有一定的療效。大量動物實驗研究證實，BMSCs移植可促進成骨分化，增加局部骨量，促進骨折愈合[32-35]。目前干細胞移植治療研究集中在動物體內實驗，主要包括單純BMSCs移植、修飾后移植和新型復合材料移植。Tewari等[36]將BMSCs移植入大鼠體內3 h后，改善了局部鈣結合能力。高翔等[37]通過肌內注射地塞米松建立大鼠骨質疏松性骨缺損模型，BMSCs移植術后4周可分離得到BMSCs，且顯微計算機斷層掃描檢測結果表明，BMSCs細胞治療能促進激素型OPF的愈合。另一方面，大量實驗研究均在不斷地探索并驗證通過基因組織工程學技術修飾BMSCs可不同程度地提高OPF的治療效果，而BMP-2互補DNA及其相應的重組體蛋白具有克服調節屏障的優勢，顯示出一定的安全性和生物學作用[38]，為OPF的治療提供了新的可能。Xu等[39]發現，基因修飾后的BMSCs與細胞外基質混懸液可抑制脂肪細胞分化相關轉錄因子PPAR的表達，顯著增強成骨分化能力，改善骨質疏松。邢德國[40]將BMP-2和胰島素樣生長因子1共轉染的BMSCs注射于糖尿病大鼠骨折局部，結果骨密度以及骨痂最大橫截面積顯著改善，成熟軟骨細胞分化和成骨細胞增殖顯著提高。

隨著研究技術及機制的不斷深入，越來越多的移植方式被發明。構建復合材料對移植治療骨折也有顯著療效，Li等[41]證實，Si@SiO2納米復合材料(160 μg/mL，pH 7.4，37.0 ℃)的干預可以上調CXCR-4 核酸的表達水平，提高BMSCs的遷移數量，降低活性氧化物的表達，保護BMSCs免受H2O2誘導的成骨分化的抑制作用，促進大鼠股骨開放性骨折的體內愈合。Hu等[42]研究表明，合成銀納米粒子在濃度為4 μmol的特定濃度時，可誘導溴脫氧尿嘧啶核苷濃度增加，促進小鼠BMSCs增殖，利于骨折愈合。

4 小 結

骨是一種動態組織，通過成骨細胞介導骨形成的平衡作用維持其對機體的支撐作用。BMSCs可通過多種機制有效治療骨損傷，具有廣闊的應用前景。但是BMSCs移植治療OPF還處在動物實驗階段，存在統一移植量、移植純度和歸巢率優化、移植細胞代數和治療時間窗等問題。近年來，BMSCs相關的臨床試驗不斷增加。在將來，OPF患者可能會取其親代(兒子或孫子)的BMSCs進行體外增殖，以促進骨折愈合，具有操作簡單、創傷小、可重復注射、免疫原性弱以及可實施性的優點，但仍需進一步的臨床試驗提供理論支持。同時，在手術內固定穩定的情況下，聯合BMSCs移植可能更有利于骨折愈合，可能會為OPF的治療帶來更有效的臨床效果。