膽堿能抗炎通路在炎性疾病中的應用研究進展

吳娟，金曼，黎筆熙

(中部戰區總醫院麻醉科，武漢 430070)

傳統觀點認為炎癥反應過程由體液途徑調控，即免疫細胞產生的炎癥因子與抗炎因子共同維持機體促炎反應與抗炎反應的平衡，一旦該平衡被打破將發生失控性炎癥反應或免疫抑制。2000年，Borovikova等[1]發現，除體液途徑外，神經系統也參與炎癥反應的調控，他將此途徑命名為膽堿能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP)，即迷走神經將炎癥刺激信號傳至中樞神經系統(central nervous system，CNS)進行整合，CNS將整合后的信號傳至迷走神經末梢并釋放乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)，ACh與炎癥細胞表面的α7亞基N型膽堿能受體(α7 nicotinic acetylcholine receptors，α7nACHR)結合，從而調節炎癥細胞產生炎癥因子。α7nACHR是CAP最顯著的特征，通過激活或抑制α7nACHR能調控CAP的活性。α7nACHR隸屬于煙堿樣ACh受體，以ACh和膽堿作為內源性配體，由5個α7亞基組成，廣泛分布于神經系統的突觸前膜和突觸后膜以及肺泡上皮細胞和巨噬細胞等免疫細胞表面；另外，α7nACHR屬于離子通道受體，對Ca2+有很好的通透性， 因此，α7nACHR介導的許多生理活動與Ca2+內流有關[2]。CAP在全身炎癥反應和各種炎性疾病的發生、發展中發揮著重要作用。現就CAP在炎性疾病中的應用進展予以綜述。

1 CAP的組成及作用機制

當致病原刺激組織產生炎癥因子時，傳入迷走神經將刺激信號傳至CNS，并釋放ACh與前腦基底部膽堿能神經元表面的M1受體結合，增強傳出迷走神經的活性[3]；傳出迷走神經刺激支配脾臟的兒茶酚胺能纖維釋放去甲腎上腺素，去甲腎上腺素與脾臟中表達膽堿乙酰轉移酶的T細胞表面的β2受體結合，刺激T細胞合成大量的ACh，ACh與免疫細胞表面的α7nACHR結合[4]。α7nACHR被激活后能增加免疫細胞內的Janus激酶/信號轉導及轉錄激活因子(Janus kinase/signal transducers and activator of transcription，JAK/STAT)，同時抑制核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)信號轉導通路，從而減少免疫細胞中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、高遷移率族蛋白1、白細胞介素-1β、白細胞介素-6等炎癥因子的產生，并提高血清中白細胞介素-10等抗炎因子水平[5-6]，若α7nACHR被藥物阻斷或其基因被剔除，CAP則無法發揮炎癥調控作用[7]。大量實驗表明，當組織發生失控性炎癥反應時，外周直接迷走神經刺激(vagus nerve stimulation，VNS)或外周使用煙堿、GTS-21等α7nACHR激動劑均能顯著降低組織與血清中TNF-α、白細胞介素-1β等炎癥因子水平，緩解組織損傷并保護器官功能，但輔以α7nACHR阻斷劑后這種保護作用則消失[8-14]。近年來隨著對CAP作用機制的深入研究，Ren等[8]發現，除刺激外周的α7nACHR外，腦室內使用α7nACHR激動劑能激活神經元表面α7nACHR，解除炎癥導致的外周免疫功能抑制，并減輕重要器官的組織損傷；Sun等[15]在基因表達水平對CAP進行了研究，認為α7nACHR被激活后細胞內的抗炎機制由miR-124介導，miR-124通過作用于STAT3激動劑和TNF-α轉化酶，抑制白細胞介素-6和TNF-α的產生，而煙堿能上調巨噬細胞內miR-124的表達。早期研究認為脾臟是CAP主要的效應器官，但Matteoli等[16]發現，CAP在腸道中的抗炎作用不依賴脾臟，迷走神經直接支配腸道神經元，腸道神經元發出的膽堿能纖維能直接作用于常駐巨噬細胞表面的α7nACHR，因此VNS可不依賴脾臟直接通過腸道神經元刺激巨噬細胞，從而抑制炎癥因子的產生。

2 CAP在炎性疾病中的應用

2.1感染性休克 感染性休克由大量病原體入侵引起，病原體通過毒素和脂蛋白等抗原刺激體內的白細胞，被激活的白細胞經血液遷移至病灶并釋放大量蛋白酶和炎癥因子以對抗入侵的病原體，但同時這些物質會損傷機體的內皮細胞與上皮細胞，使病原菌易移位至其他器官(如肝臟、肺臟)，造成多器官功能障礙[8]；另外，受損的血管內皮細胞會激活凝血過程并引起纖溶過程的雙向改變，而炎癥因子會抑制凝血因子的功能，造成凝血功能異常和微循環障礙[17]；在感染性休克晚期，脾臟中淋巴細胞與樹突狀細胞的凋亡率增加，機體免疫功能被抑制，使患者病情進一步加重，甚至死亡[9]。CAP在感染性休克時能發揮重要的調節作用，內源性ACh通過促進脾臟中淋巴細胞增殖，減輕機體炎癥反應，抑制血清中細菌生長和中性粒細胞遷移[9-10]。Cedillo等[18]發現，敗血癥患者單核細胞的α7nACHR基因表達增加，其表達水平與炎癥反應程度和預后相關。大量動物實驗表明，VNS或α7nACHR激動劑能顯著降低敗血癥小鼠血清中的白細胞介素-1β、白細胞介素-6水平和病死率[8-10,19]；進一步研究發現，在敗血癥小鼠皮下注射M1-R激動劑也能產生類似于α7nACHR激動劑的抗炎作用[20]；腹腔注射毒扁豆堿(一種抗膽堿酯酶抑制劑)也能抑制NF-κB活性，降低血清TNF-α水平并提高小鼠生存率[21-22]，表明經外周刺激M受體同樣能減輕全身炎癥反應，其機制可能與CNS毒蕈堿網絡影響CAP活性有關。目前，德國一項針對毒扁豆堿輔助治療圍手術期感染性休克患者的臨床試點試驗正在進行中，該試驗旨在研究能否將毒扁豆堿誘導的CAP抗炎作用安全、有效地應用于臨床治療[23]。

除減輕感染性休克的炎癥反應外，VNS(5 V，2 ms，1 Hz)能減少敗血癥小鼠血清中TNF-α的含量，解除炎癥因子對凝血因子功能的抑制，適當糾正凝血與纖溶過程紊亂，減輕微循環障礙[17]；外周使用GTS-21還能減輕敗血癥所致的大腦、心臟、肺臟、腎臟等器官組織損傷，保護器官功能，其保護機制均與GTS-21刺激免疫細胞表面的α7nACHR有關[24-26]。如GTS-21刺激肺泡巨噬細胞表面的α7nACHR，抑制肺泡巨噬細胞分化為M1型，從而減少M1型肺泡巨噬細胞釋放炎癥因子，減輕肺臟組織損傷[24]。

2.2失血性休克(hemorrhagic shock，HS) HS的病因是大量出血導致有效循環血量不足，引起外周血管收縮與微循環障礙。HS的病理生理變化較復雜，有效循環血量降低會導致心臟、腦、腸道等重要器官灌注不足，其中腸道灌注不足引起腸黏膜屏障功能損傷，使腸道菌群或炎癥細胞移位至腸系膜淋巴結，經淋巴液的全身循環引起全身炎癥反應[27]；此外，大量失血會導致細胞因氧供應不足而釋放大量損傷相關因子，從而引起組織的炎癥反應[28]。同時，系統性炎癥激活機體凝血過程，加以血管內皮細胞損傷與血小板丟失共同導致大量血栓形成或凝血障礙，加劇HS的病理生理過程[29]。

CAP能調控HS導致的系統性炎癥與組織損傷。Guarini等[6]發現，VNS(5 V，2 ms，1 Hz)能抑制HS大鼠肝臟中NF-κB活化，降低肝臟與血清中TNF-α水平，糾正低血壓并提高大鼠生存率，而皮下注射N型膽堿能受體阻滯劑氯異吲哚銨會逆轉上述保護作用。進一步研究表明，VNS的這種抗炎作用與減輕腸黏膜屏障損傷、降低腸道屏障通透性和淋巴液毒性有關[28,30-31]，但具體作用機制不明。另一方面，VNS能增加腸系膜淋巴結中CD103+樹突狀細胞的數量與T淋巴調節細胞/輔助性T細胞(helper T cell，Th)17的比例，提高腸道對炎癥的耐受性，進而減輕腸黏膜屏障損傷[32]。有活性的腸系膜淋巴液通過全身循環引起遠處臟器的炎癥反應，其中肺臟是最易受損的器官，VNS通過減輕腸淋巴液毒性可降低肺血管通透性，抑制中性粒細胞的激活與聚集，降低髓過氧化物酶和細胞間黏附因子1的水平，減輕肺組織學損傷[30,33-34]。除VNS外，迷走神經激動劑和煙堿也具有減輕HS后腸道損傷與肺損傷的作用[28-31]。另外，Rezende-Neto等[29]發現，VNS(3.5 mA，5 Hz)通過降低HS大鼠體內白細胞介素-1β水平，解除炎癥介質對凝血因子功能的抑制，從而促進凝血過程，改善HS的病理生理過程。

2.3癌癥 炎癥反應與癌癥密切相關，炎癥在腫瘤的各個階段(如增殖、遷移、侵襲和轉移過程)發揮著至關重要的作用[35]，如潰瘍性結腸炎患者易患結腸癌，哮喘、慢性阻塞性肺疾病患者易發展為肺癌，這與炎癥微環境刺激組織細胞發生惡變有關[36-37]。炎癥反應產生大量的致癌介質(如活性氧類、活性氮類和自由基)，這些致癌介質會導致DNA損傷，甚至突變，從而使正常組織細胞發生癌變[38-39]。肺組織和結腸組織中分布著廣泛的迷走神經，迷走神經末梢存在大量炎癥因子受體和感受器，因此，當肺組織和結腸受到炎癥因子刺激時，刺激信號便由迷走神經傳至CNS進行整合，整合后的信號由迷走神經傳出，迷走神經末梢釋放ACh與肺組織和結腸中炎癥細胞表面的α7nACHR結合，抑制炎癥細胞產生促炎介質并減輕肺組織和結腸中的炎癥反應[40]，因此，可以通過刺激α7nACHR減輕肺組織和結腸的炎癥反應來抑制癌細胞增殖。De Couck等[41]已證實，迷走神經活性越高的非小細胞肺癌患者預后越好，這與迷走神經通過ACh和α7nACHR調控肺組織炎癥反應有關；此外，Hayashi等[42]發現，煙堿能下調小鼠結腸組織中炎癥因子(白細胞介素-6/STAT3和TNF-α)的表達，降低結腸腫瘤的發生率。

2.4克羅恩病 克羅恩病的特征是腸道神經元缺失、大量炎癥細胞浸潤及炎癥因子產生造成的腸道組織損傷[43]。VNS直接刺激腸道神經元和與之相連的膽堿能纖維，增加神經纖維末梢釋放的ACh水平，ACh與腸道巨噬細胞表面的α7nACHR結合，減少巨噬細胞中炎癥因子的產生，從而抑制腸道的炎癥反應[16,44]。動物實驗表明，VNS(0.5～1.5 mA，10 Hz，500 s)能降低結腸炎大鼠體內髓過氧化物酶和炎癥因子水平，減輕結腸組織損傷[45-46]；國外一項臨床試驗證明，VNS(0.5～1.5 mA，10 Hz，500 s)能降低克羅恩病患者體內C反應蛋白水平，改善患者的臨床癥狀[47]。此外，Bai等[48]在動物實驗中發現，腹腔注射膽堿能激動劑假木賊堿可以降低結腸炎小鼠結腸組織中髓過氧化物酶、TNF和NF-κB水平，緩解結腸組織損傷，這與假木賊堿作用于腸道巨噬細胞表面的α7nACHR抑制炎癥因子釋放有關。

2.5類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA) RA的病理特征是滑膜的持續炎癥致使骨與軟骨損害，最終導致關節畸形[49]。煙堿等α7nACHR激動劑能與滑膜中免疫細胞表面的α7nACHR結合并激活CAP，減少免疫細胞產生炎癥因子，進而抑制RA的滑膜炎癥反應。有研究發現，關節炎大鼠口服或腹腔注射煙堿均能降低滑膜中TNF-α等炎癥因子水平，進而抑制滑膜中Th17細胞增生，并改善Th1/Th2比值失衡，減輕骨與軟骨損害[50-51]。此外，RA的發生、發展與迷走神經功能紊亂有關，臨床前RA患者迷走神經活性越低，則發展成RA的可能性越大；RA患者迷走神經活性越低，則臨床癥狀越重且對藥物反應越差[49]。臨床試驗證明，在RA患者體內植入迷走神經刺激儀并用相應的電壓、頻率和波長刺激外周迷走神經，能降低TNF-α等炎癥因子水平，改善RA患者的癥狀[52]。

2.6阿爾茨海默病 腦組織中β淀粉樣蛋白沉積是阿爾茨海默病的特征性改變。小膠質細胞是大腦中的單核巨噬細胞，它通過吞噬腦組織中的β淀粉樣蛋白維持β淀粉樣蛋白的平衡，而小膠質細胞的功能受星形膠質細胞的調控，但具體調控機制不明[53]。既往研究表明，小膠質細胞表面存在煙堿樣ACh受體，口服或注射煙堿、加蘭他敏等非選擇性膽堿能受體激動劑能抑制腦組織中β淀粉樣蛋白的聚集，促進小膠質細胞吞噬β淀粉樣蛋白的過程[54-56]。研究表明，GTS-21能促進小膠質細胞吞噬β淀粉樣蛋白的過程，在阿爾茨海默病大鼠中使用選擇性膽堿能受體激動劑GTS-21能減少大腦中β淀粉樣蛋白含量，并緩解大鼠記憶功能損傷，由此說明，α7nACHR在小膠質細胞的吞噬過程中發揮著重要作用，α7nACHR可作為治療阿爾茨海默病的靶點之一[57-58]。

2.7腦卒中 炎癥反應在腦卒中的各個病理階段均發揮著重要作用，腦缺血或顱內出血刺激小膠質細胞釋放大量促炎因子，這些細胞因子一方面在梗死區域產生局部炎癥反應；另一方面透過血腦屏障進入血液，吸引血液中的巨噬細胞聚集到梗死區域，浸潤的巨噬細胞產生大量炎癥介質和活性氧類，造成神經元損傷[59]。腹腔注射GTS-21(4 mg/kg)等α7nAChR激動劑能與巨噬細胞表面的α7nAChR結合，抑制巨噬細胞產生活性氧類和白細胞介素-6、TNF-α等炎癥因子，從而緩解腦卒中大鼠腦組織中炎癥反應與神經元凋亡，改善腦組織損傷[13-14,60]；另外，VNS和經皮迷走神經刺激也具有減輕腦卒中后腦組織損傷的作用，其作用機制可能與上調免疫細胞和神經元表面的7nAChR有關[14,61]。另外，炎癥反應在子癇前期[62]和抑郁癥[63]等疾病的發生、發展中均扮演重要角色，而CAP的炎癥調控作用對這些疾病的發展和轉歸均具有重要意義，但研究結果尚需大樣本臨床試驗進行驗證。

3 小 結

CAP在上述炎性疾病的病理生理過程中發揮著重要的調控作用，刺激CAP能夠抑制炎癥反應過程，從而減輕過度炎癥反應造成的組織損傷和器官功能損害，最終緩解患者臨床癥狀，甚至改善患者預后。但目前臨床上用于刺激CAP的手段十分有限，7nAChR激動劑除GTS-21外均不能用于臨床治療。雖然美國食品藥品管理局已經批準將VNS用于癲癇患者，并且VNS對癲癇患者表現出良好的治療作用[64]，但VNS對其他炎性疾病的治療效果和安全性沒有大樣本臨床試驗的驗證。因此，適用于臨床的新型7nAChR激動劑的研究及VNS治療炎性疾病的大樣本臨床隨機對照試驗是CAP未來的重點研究方向。