長鏈非編碼RNA與癲癇相關性研究進展

劉鵬鵬，宮玉哲，令調文，王天成

(蘭州大學第二醫院神經內科-癲癇中心，蘭州730000)

非編碼RNAs是一類不具備蛋白編碼功能的RNA分子，作為表觀遺傳的重要因子參與基因的表達調控。非編碼RNAs可分為微RNA(microRNA，miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)等[1]。miRNA可通過多種調控方式參與包括癲癇在內的多種神經系統疾病的發生發展[2-3]。miRNA僅占非編碼轉錄本的一小部分，而lncRNA在非編碼RNAs中占比更大[4-5]。目前已鑒定出多種lncRNA，但其在哺乳動物神經系統中的功能還需深入研究。越來越多的證據顯示，lncRNA在腦發育、成熟、神經分化、神經細胞特異性、神經再生、髓鞘形成、神經傳遞、突觸可塑性中發揮重要作用[6-7]。已經有研究證明，lncRNA與阿爾茨海默病、癲癇等神經系統疾病相關[8-9]。

癲癇是一種常見的神經系統疾病，是遺傳與環境因素共同作用的結果。大腦興奮性異常可導致癲癇發生，而腦興奮性與離子通道及遞質受體密切相關。基因表達異常致通道開關和受體傳遞異常可導致神經元興奮性的產生和傳導異常，這可能是癲癇的病理生理基礎。lncRNA作為非編碼RNA中的重要一類，參與多種基因的表達調控，通過影響癲癇相關基因的表達，最終參與癲癇發生[9]。此外，lncRNA具有疾病特異性，不同疾病中特異性lncRNA的表達存在差異，提示lncRNA可作為癲癇診斷和預后判斷的指標，同時也可作為治療靶點，為癲癇的治療提供新方向。現就lncRNA與癲癇的相關性進行綜述，探討其在癲癇發病、診斷、治療等方面的應用前景。

1 lncRNA

1.1lncRNA的結構 lncRNA是長度大于200個核苷酸的轉錄本，來源于DNA模板鏈的轉錄，是哺乳動物基因轉錄組的重要組成成分[4]。根據lncRNA與附近蛋白編碼基因的關系，可以分為基因內lncRNA、正義lncRNA、反義lncRNA等[1,10]。lncRNA定位在特定類型細胞和亞細胞結構中，大多定位于細胞核，并呈動態表達[11-12]。lncRNA因缺乏序列保守性，起初被認為是一種“轉錄噪音”[4]。隨著測序技術的發展，越來越多的lncRNA被鑒定出來，并參與基因調控的多個步驟[13-15]，但其作用機制復雜，尚有待深入研究。

1.2lncRNA功能 lncRNA在基因轉錄、翻譯以及蛋白功能等多個方面發揮作用。研究發現，lncRNA可通過沉默基因表達參與基因印跡和X染色體失活[14]。?rom等[16]采用功能性敲除的方法對預篩的3 019種lncRNAs進行功能鑒定，確定了某些lncRNA對蛋白質編碼基因的正向調控作用，具有類似于增強子的作用。目前已知的lncRNA的作用機制有：①與啟動子結合，阻礙RNA聚合酶Ⅱ發揮作用，抑制下游基因表達；②誘導染色質重塑，使其易與轉錄因子結合，促進下游基因表達；③與正反義lncRNA結合，干擾剪切酶對信使RNA的剪切，進一步影響翻譯；④產生內源性小干擾RNA，通過結合到相關基因轉錄關鍵部位，下調基因的表達；⑤與特異性蛋白結合，調節該蛋白活性；⑥是某些復合物的結構和組成成分；⑦影響蛋白定位，進而影響蛋白的正常功能；⑧是其他小分子RNA的前體[4-5,17]。lncRNA的功能具有多樣性，其調控和作用靶點涉及基因表達的多個方面，對基因正常表達、蛋白正常發揮功能起關鍵作用。

2 lncRNA與癲癇發生

2.1lncRNA與神經分化 lncRNA存在于人體的各個系統組織中，功能注釋表明40%的lncRNA在腦中差異表達[18]，并具有時間和空間表達上的特異性，某些lncRNA只在特定腦區表達[19]。隨著高通量測序技術的發展，已經鑒定出多種神經lncRNA。lncRNA參與腦發育的多個過程，如神經元分化、突觸重塑等[12,19]。通過對成年鼠腦室-室下區(ventricular-subventricular zone，V-SVZ)的神經干細胞進行研究發現，一些lncRNA是V-SVZ生發區長期自我更新和神經源性能力的基礎[20]。由此說明，神經系統發育和神經疾病的發生與lncRNA的關系密切。

神經分化是一個精細的過程，需要對干細胞或祖細胞的增殖和分化進行精確的時空調控。研究表明，某些lncRNAs與神經元分化基因的調控密切相關，各種lncRNA的調控方式也不盡相同。長基因間非蛋白質編碼RNA PNKY是一種含有825個堿基對的lncRNA，在神經組織中特異性表達，是調節胚胎和出生后大腦神經干細胞分化的調節因子，在V-SVZ的神經干細胞中富集，PNKY與信使RNA剪接調節子聚嘧啶帶結合因子1相互作用，抑制神經分化相關基因的表達[21]。橫紋肌肉瘤相關轉錄本2也是一種神經特異性lncRNA，與SRY盒轉錄因子2共同調控下游大量神經發生相關基因，兩者均在神經組織中特異性表達，敲除橫紋肌肉瘤相關轉錄本2顯著抑制了神經發生，其正向調控神經分化[22]。同樣的，Dlx5/6是關鍵的神經源性轉錄因子，lncRNA Evf2是其正常表達所必需的，lncRNA Evf2缺失將會導致神經元產生缺陷[23]。綜上所述，lncRNA與神經發育和分化密切相關，異常的lncRNA可能會導致異常的神經發育，進而致病。

2.2lncRNA與突觸 `神經突觸形成是神經發育的重要部分，是建立正常大腦功能的結構基礎。各種刺激誘導的突觸重塑與正常腦功能的維持及疾病的發生發展相關[24-25]。癲癇是以突觸連接為核心的神經疾病，由炎癥、創傷等所致的繼發性癲癇的形成與突觸重塑關系更為密切，尤其是在顳葉癲癇中[26]。lncRNA參與了突觸的形成和重塑。最早發現的與突觸形成相關的lncRNA是BC1/BC200，在神經發育過程中其在樹突處發揮作用，能夠靶向抑制突觸蛋白形成，該因子的異常可導致突觸形成異常[27]。一些反義lncRNA調控幾種重要的突觸形成蛋白，包括腦源性神經生長因子(brain-derived neurotropic factor，BDNF)、膠質細胞源性神經營養因子等，lncRNA BDNF-AS是BDNF的反義轉錄本，其能提高BDNF的蛋白水平，而BNDF水平的升高促進了神經元增殖、分化及突觸形成。反義lncRNA通過調控局部基因的表達，調控神經元突觸形成[28]。轉移相關肺腺癌轉錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)是另一個重要的突觸形成因子。體外研究發現，MALAT1主動招募剪接蛋白到轉錄位點，以控制突觸相關基因的表達，敲除MALAT1后突觸密度降低，過表達后突觸密度升高[29]。已經發現lncRNA鉀電壓門控通道亞家族Q成員2(voltage-gated potassium channel subfamily Q member 2，KCNA2)-AS通過與KCNA2結合，選擇性下調KCNA2信使RNA和蛋白水平，調節損傷后神經突觸的可塑性[30]，從而影響高級神經功能，這可能與慢性癲癇患者的皮質功能損傷相關。

2.3lncRNA與通道、受體 lncRNA也可通過影響離子通道和遞質受體參與癲癇的發生，此類研究多集中在癲癇動物模型中。Luo等[31]研究發現，顳葉癲癇大鼠的非編碼RNA中存在54個差異表達的lncRNA，功能分析顯示這些lncRNA與電壓門控鉀離子通道活性和轉運活性密切相關。Barry等[32]發現，lncRNA核富集轉錄體1通過與癲癇相關鉀通道相互作用蛋白結合，調控神經元活性；用反義寡核苷酸功能性敲除lncRNA核富集轉錄體1后，誘導多能干細胞衍生的人類皮質神經元出現神經元超興奮性表型，表明lncRNA核富集轉錄體1整體對神經元興奮性起負調控作用。Li等[33]認為，lncRNA生長停滯特異性轉錄本5作為miR-135a-5p的競爭性內源性RNA，可以增加KCNQ3的表達，lncRNA生長停滯特異性轉錄本5沉默可以抑制癲癇的發生和進展。鈣電壓門控通道輔助亞基γ2(calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 2，CACNG2)是一種膜蛋白，通過調節α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸受體的功能和分布影響大腦興奮性神經傳遞[34]。在動物模型研究中，小鼠反義lncRNA CACNG2可以調節CACNG2的表達，從而影響α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸受體的正常功能，進一步影響神經元興奮性，參與癲癇發生[35]。

總的來說，lncRNA參與多個正常的神經生理過程，異常lncRNA可在轉錄水平影響正常基因的表達，從而影響神經興奮性，導致癲癇發生。

3 lncRNA與癲癇診斷

lncRNA與癲癇的發生發展密切相關，且因lncRNA特異性的時間和空間表達以及進化保守性，提示可通過檢測特異性的lncRNA協助診斷癲癇。很多研究表明lncRNA在癲癇組織和正常組織存在差異表達。有研究者采用癲癇小鼠模型研究皮質和海馬區lncRNA和信使RNA的表達情況，最終確定了10種與信使RNA相關的差異表達的lncRNA[36]。Luo等[31]利用非編碼RNA芯片檢測發現，顳葉癲癇大鼠中有54個差異表達的lncRNA。已知移行細胞癌相關因子1(urothelial cancer associated 1，UCA1)是一種與膀胱癌發生發展相關的lncRNA[37]。Wang等[38]發現，癲癇大鼠腦組織與外周血中UCA1的表達均較正常組升高，且兩者呈正相關，提示未來有可能通過檢測外周血中的UCA1診斷癲癇。另一項研究發現，顳葉癲癇患者海馬區的UCA1存在異常甲基化[39]。BDNF是重要的神經生長因子，lncRNA BDNF相反鏈可以負性調控BNDF[40]。Iughetti等[41]研究發現，癲癇患者放電高峰值區BNDF的表達上調，且外周血中的BNDF與腦組織中的BNDF同步升高，而lncRNA BDNF相反鏈可通過下調BNDF抑制BDNF介導的癲癇放電，提示外周血BDNF可作為判斷癲癇嚴重程度的指標。

在癲癇患者中也檢測到差異表達的lncRNA。Hashemian等[42]研究發現，癲癇患者外周血中lncRNA HOXA簇反義RNA 2和Sprouty RTK信號拮抗劑4內含子轉錄本1明顯高于正常對照組。對兒童顳葉癲癇的研究發現，維生素D受體基因多態性與癲癇的發生相關[43]。Mazdeh等[44]則發現，癲癇患者外周血中維生素D受體相關lncRNA與正常對照組相比存在差異表達。由此可見，正常組織和癲癇組織中差異表達的lncRNA可能作為一種生物標志物為癲癇的診斷提供客觀指標。

4 lncRNA與癲癇治療

癲癇的傳統治療手段是藥物治療，但有30%的癲癇患者最終發展成難治性耐藥性癲癇，癲癇頻繁發作會對患者的身心健康造成嚴重損害[45-46]。因此，針對耐藥性癲癇開發更多的新型治療手段有重大意義。目前已知的新型治療技術包括迷走神經刺激術、深部核團刺激術、經顱磁刺激技術、生酮飲食等[47]，基于lncRNA的基因療法已成為一種潛在的治療策略，并在部分動物實驗中得到證實[33,48-49]。Dravet綜合征是一種鈉電壓門控通道α亞基1(sodium voltage-gated channel alpha subunit 1，SCN1A)基因單倍體不足所致的遺傳性癲癇性腦病[50]。Hsiao等[48]研究發現，利用寡核苷酸靶向反義lncRNA SCN1ANAT可以上調SCN1A基因的表達，改善癲癇表型，降低海馬神經元興奮性。Angelman綜合征是由一種編碼E3泛素連接酶的印跡基因UBE3A(ubiquitin protein ligase E3A)母系缺陷，而父系來源的UBE3A被lncRNA UBE3A-ATS沉默所引起的疾病，表現為精神發育遲緩、癲癇發作等，藥物治療效果差[51-52]。Meng等[49]研究發現，利用反義寡核苷酸特異性抑制模型鼠中lncRNA Ube3a-ATS維持神經元中Ube3a的非沉默狀態，可改善Angelmen綜合征相關癥狀。此外，lncRNA還可用于減少癲癇發作所致的腦損傷。在小鼠毛果蕓香堿癲癇模型中，lncRNA UCA1可通過miR-495/核因子類紅細胞2相關因子2通路，抑制癲癇小鼠海馬神經元凋亡，從而抑制癲癇和癲癇后腦損傷[53]。Wu和Yi[54]研究發現，采用小干擾RNA下調lncRNA MALAT1可激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路，保護癲癇大鼠海馬神經元免受自噬和凋亡的影響。Li等[55]也發現，進化保守的lncRNA FTX(five prime to XIST)在癲癇持續狀態誘導的海馬硬化過程中起抗神經元凋亡的作用。以上證據均表明lncRNA有可能成為癲癇治療的新靶點。

5 小 結

隨著基因技術的發展，非編碼RNA靶向治療作為一種新的治療方式被不斷研究。lncRNA在阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈病等神經退行性疾病以及抑郁癥等精神疾病中的研究已較為成熟，其可能為這些疾病的診斷、治療以及預后提供幫助[56-57]。lncRNA通過參與神經分化、突觸形成以及影響通道、受體等參與癲癇的發生發展，lncRNA可直接或間接影響癲癇相關基因，而lncRNA的失調參與了癲癇的發病。在癲癇患者和小鼠模型的腦組織中均檢測到了特異性lncRNA的異常表達，且外周血中lncRNA與腦中lncRNA的變化呈正相關，提示外周血lncRNA可以反映腦內lncRNA的變化，其可作為癲癇診斷和判斷預后的生物標志物。通過干預外周血中異常的lncRNA治療腦內lncRNA異常所致癲癇可能是一種潛在的治療策略，但其應用于臨床診療還需要進行更深入的研究，不僅需要擴大樣本量，重復動物實驗，還需要進行大量的臨床試驗加以驗證。高通量測序技術的發展必然會使研究者發現更多的癲癇相關lncRNA，通過轉基因動物模型、誘導多能干細胞等技術研究其特異性功能，同時借鑒lncRNA在其他疾病中的應用模式，其在癲癇診治中的應用將成為可能。

目前癲癇的診斷仍依賴臨床癥狀和腦電圖，部分依賴于基因檢測，具備臨床實用性的生物標志物仍然較少。癲癇治療亦多局限于宏觀治療，分子靶向治療研究較少。基因檢測及編輯技術的發展使lncRNA可作為生物標志物應用于臨床診斷，也可作為治療靶點應用于臨床治療，而功能的多樣性以及組織和疾病的特異性提高了其應用潛能。