甲狀腺癌中miR-222關鍵靶基因預測及其信號通路分析

黃琪峰 鄭琳琳 張菁

摘要：目的? 利用生物信息學技術預測人類miR-222的靶基因，并分析其可能參與甲狀腺癌的生物學過程和信號通路。方法? 通過TCGA數據庫研究miR-222的表達與甲狀腺癌的關系，然后TCGA中表達下調的基因和網站預測的miR-222靶基因進行取交集得到重疊基因，再進行生物信息學分析確定與甲狀腺癌相關的關鍵miR-222靶基因和通路，最后通過GEPIA對靶基因進行表達驗證以及miR-222和靶基因的相關性分析。結果? miR-222在甲狀腺癌中表達上調，富集分析表明miR-222很有可能參與血管緊張素受體-配體結合的調節，其中一個可能的靶基因是AGTR1，其在甲狀腺癌中表達下調，與miR-222的表達呈負相關。結論? 上調的miR-222可能以AGTR1為靶標，從而調節甲狀腺癌中血管緊張素受體-配體結合發揮作用。

關鍵詞：甲狀腺癌;miR-222;AGTR1;生物信息學

中圖分類號：R736.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.01.026

文章編號：1006-1959（2020）01-0085-04

Prediction of Key Target Genes of miR-222 in Thyroid Cancer and Analysis of Its Signal Pathway

HUANG Qi-feng1，ZHENG Lin-lin2，ZHANG Jing1

（Department of Pharmacy1，Department of Ultrasound2，Run Run Shaw Hospital，Zhejiang University School of Medicine，

Hangzhou 310016，Zhejiang，China）

Abstract：Objective? To predict the target genes of human miR-222 using bioinformatics technology， and analyze the biological processes and signal pathways that miR-222 may participate in. Methods? TCGA database was used to study the relationship between miR-222 expression and thyroid cancer， then the genes with down-regulated expression in TCGA and miR-222 target genes predicted by the website were intersected to obtain overlapping genes， and bioinformatics analysis was performed to determine the correlation with thyroid cancer the key miR-222 target genes and pathways， and finally the target genes were verified by GEPIA and the correlation analysis between miR-222 and target genes. Results? miR-222 expression was significantly up-regulated in thyroid cancer. Enrichment analysis showed that miR-222 is likely to be involved in the regulation of angiotensin receptor-ligand binding. One of the possible target genes is AGTR1， which is expressed in thyroid cancer.Down-regulation was significantly negatively correlated with miR-222 expression.Conclusion? The up-regulated miR-222 is likely to target AGTR1， which may play a role in regulating angiotensin receptor-ligand binding in thyroid cancer.

Key words：Thyroid cancer;miR-222;AGTR1;Bioinformatics

甲狀腺癌（thyroid cancer）是最常見的內分泌性惡性腫瘤，發病率逐年升高，嚴重威脅著人類的生命健康[1]。甲狀腺癌的發生發展受多種調控因子共同作用，其具體機制目前尚不明確，因此確定其具體的發病機制，發現敏感的生物標志物和創新治療方法來提高甲狀腺癌的臨床診斷和治療水平是緊迫且具有挑戰性的課題。微小RNA（miRNA）是一類含量豐富的非編碼RNA分子，大小為15～21個核苷酸，它通過與目標基因的3'非翻譯區域互補結合從而使目標基因沉默。miRNA已經被證實對廣泛的生物過程具有調節作用，如細胞增殖、凋亡、分化和細胞周期調節[2，3]。miRNA使癌癥在臨床診斷和治療中取得了較大進展[4，5]。研究表明[6]，miR-222在甲狀腺癌中表達明顯高于正常組織，提示其可能在甲狀腺癌的發生發展中具有重要的作用，因此探索其在甲狀腺癌發病中的分子機制具有重要的意義。本研究利用生物信息學的方法來預測miR-222在甲狀腺癌中的目標基因及其參與的信號通路，旨在闡明甲狀腺癌的潛在生物標志物，為進一步深入研究其生物功能及臨床治療甲狀腺癌提供線索。

1資料與方法

1.1資料來源? 從TCGA 數據庫（https：//cancergenome.nih.gov/）下載510例甲狀腺癌和58例癌旁組織的mRNA-seq數據和miRNA-seq數據，并取Log2將其表達值標準化。從miRWalk（http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）數據庫[7]下載人類miR-222可能的靶基因數據。

1.2方法

1.2.1 miR-222表達? 選取miR-222在甲狀腺癌及其癌旁組織的表達數據，利用GraphPad Prism7繪制其在癌組織和正常組織的表達圖。

1.2.2 miRNA的差異表達? 利用計算機R軟件中edgeR包篩選出510例癌癥組織與58例癌旁組織相比表達下調的基因，篩選條件為：Log2|差異倍數（FC）|<-0.5489，FDR<0.05。為了更好更準確的識別miR-222的目標基因，對miRWalk網站預測的基因與表達下調的基因取交集，然后根據這些重疊基因進行生物信息學分析來探索miR-222在甲狀腺癌中潛在分子機制。

1.2.3基因富集分析? 利用DAVID[8]（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）對重疊基因進行功能注釋，包括分子功能、細胞組成與生物過程的GO功能富集分析及KEGG通路富集分析。

1.2.4重疊基因蛋白互作網絡? 通過在線分析網站STRING[9]（https：//string-db.org/）得到差異表達基因的蛋白互作網絡，將所得源文件導入Cytoscape[10]進行可視化分析，然后使用MCODE插件查找蛋白互作網絡中連接最密集的區域。

1.2.5 GEPIA數據庫分析目標基因表達? 通過GEPIA數據庫[11]（http：//gepia.cancer-pku.cn/）驗證目標基因在癌癥組織與癌旁組織的基因表達差異，并利用GraphPad Prism7繪制目標基因的表達量與miR-222的相關性。

1.3統計學分析? 標準化后的mRNA和miRNA表達呈正態分布，采用非配對t檢驗其在癌組織和癌旁組織中的表達差異，采用Pearson相關性分析目標基因與miR-222的表達相關性。P<0.05表示差異有統計學意義，在篩選差異表達基因和對重疊基因富集分析時用Benjamini-Hochberg方法校正P值（FDR）。

2結果

2.1甲狀腺癌組織和癌旁組織中miR-222表達比較? 從TCGA下載得到的miR-222在甲狀腺癌中和癌旁組織的表達，miR-222在甲狀腺癌中表達高于癌旁組織，差異有統計學意義（P<0.05），見圖1。

2.2 miR-222的目標基因? 通過TCGA中基因的差異表達分析和miRWalk靶基因預測平臺可以篩選出miR-136-5p可能的靶基因。其中TCGA中甲狀腺癌共有801個差異表達基因，miRNA-222在甲狀腺癌組織中表達高于癌旁組織，選擇342個下調基因，miRWalk網站預測的目標基因有16912個，兩者重疊得到279個miR-222可能的目標基因。

2.3重疊基因的生物信息學分析

2.3.1 GO和KEGG 富集分析? GO分析表明重疊目標基因的生物學過程主要富集在離子跨膜轉運、消化、化學性突觸傳遞、質膜的組成成分、細胞連接、突觸、細胞外間隙、質膜等生物學過程和功能中，KEGG富集分析顯示重疊目標基因的信號通路主要為神經活性配體-受體相互作用，見表1。

2.3.2 PPI網絡的構建和目標基因分析? 根據重疊基因構建得到一個包含279個節點、527條邊的PPI網絡，利用MCODE插件在蛋白互作網絡中查找連接最密集的區域得到12個可能的目標基因，分別為SST、AGTR2、CHRM2、PENK、NPY2R、NPY5R、AGTR1、HTR1E、CCKBR、CCKAR、MLN、GCG，見圖2。

2.4目標基因的驗證

2.4.1目標基因在甲狀腺癌中的表達? 共查找到12個目標基因在甲狀腺癌中的表達，由于miR-222在甲狀腺癌中表達量比癌旁組織高，其目標基因應在甲狀腺癌中表達下調，最終篩選出AGTR1，見圖3。

2.4.2目標基因AGTR1與miR-222的Pearson相關分析? Pearson相關分析表明，目標基因AGTR1的表達與miR-222的表達在甲狀腺癌患者中呈負相關（r=-0.435，P=1.1293E-27），見圖4。

3討論

據不完全統計，約30%以上的人類蛋白編碼基因受miRNA的調控[12]。越來越多的文獻報道，miRNA可以通過調控下游靶基因的表達來參與細胞分化、增殖、凋亡等細胞活動，并在腫瘤的發生發展、侵襲與轉移[2，3]以及治療等方面發揮重要作用。但目前已明確的miRNA的靶基因數量有限，且生物學功能尚未完全明確[13]。因此，通過生物信息學預測miRNA 的靶基因，對其靶基因進行生物功能富集分析和信號通路富集分析，有助于確定miRNA的研究方向，具有重要指導意義。

研究報道，miR-222在甲狀腺惡性腫瘤診斷上具有較高的敏感性[14]，且miR-222的過度表達與甲狀腺癌復發、淋巴結轉移等一些高風險特征相關，miR-222可以作為甲狀腺癌潛在的靶點[15-17]。

本研究中，通過對TCGA數據庫中miRNA測序發現miR-222在甲狀腺癌中的表達高于癌旁組織。GO富集分析顯示，miR-222的目標基因的生物學過程主要富集在離子跨膜轉運、消化、化學性突觸傳遞、質膜的組成成分、細胞連接、突觸、細胞外間隙、質膜等生物學過程和功能中。KEGG 信號通路分析結果顯示，miR-222靶基因主要富集在神經活性配體-受體相互作用等信號通路上?；谝陨习l現，miR-222很有可能參與受體-配體結合的調節。同時，通過目標基因在甲狀腺癌組織與癌旁組織中的表達差異篩選得到目標基因AGTR1，發現在甲狀腺癌中與miR-222的表達呈負相關（r=-0.435，P=1.1293E-27）。AGTR1是血管緊張素Ⅱ的Ⅰ型受體，是調節心血管系統的受體。研究表明，AGTR1與腫瘤的進展和轉移有關，AGTR1參與多種類型的惡性腫瘤，比如乳腺癌[18]、皮膚癌[19]、前列腺癌[20]、婦科腫瘤[21]等。因此，miR-222可能是以AGTR1為靶點，通過調節腎素-血管緊張素系統，從而參與甲狀腺癌的發生發展。但這只是預測，未來需要更多的研究去證實。

綜上所述，本研究基于TCGA數據庫進行分析，發現miR-222在甲狀腺癌中表達上升，預測其靶基因可能是AGTR1，并可能通過血管緊張素配體-受體結合信號通路中調節甲狀腺癌的發生發展。

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收稿日期：2019-10-01;修回日期：2019-10-21

編輯/成森