實時熒光定量PCR技術及其在腫瘤研究中的應用*

高 紡 李 丹 余新雅

安徽中醫藥大學 1 中醫學院 2 門診部 3 針灸推拿學院，安徽省合肥市 230038

隨著時代的快速發展，先進的科學研究技術層出不窮。1987年，科學家Kary Mullis發明的聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction,PCR)技術得到了生命科學界的一致認可，并于1993年獲得諾貝爾化學獎。從此，PCR作為一種先進的研究技術，廣泛應用于生命科學研究，然而傳統的PCR技術在研究中只能進行“定性”分析，不能進行準確的定量研究，從而在臨床應用中受到很大限制。而實時熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)是在傳統PCR技術的基礎上，加入熒光基團，融合了傳統PCR高靈敏度，DNA技術的高特異性以及光譜技術的準確定量等優點，克服了PCR技術不能定量研究的缺點，同時具有高靈敏性、特異性、準確性的一種定量研究技術，能夠更早地做到腫瘤基因早期診斷[1]，已經成為醫學分子生物學中重要的研究技術之一。目前該技術已逐漸成為醫學腫瘤研究中的重要手段，將在未來腫瘤發病機制研究中占有重要位置。本文就qRT-PCR在腫瘤研究中的應用做一簡要綜述如下。

1 qRT-PCR技術概述

1.1 原理 qRT-PCR技術是以傳統的PCR技術為基礎，將熒光基團加入PCR反應體系中，通過熒光信號長時間累積進行的檢測，最后通過標準曲線進行定量分析。在qRT-PCR技術中，Ct是指PCR技術檢測的過程中，熒光信號達到設定的熒光閾值所循環的次數，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。

1.2 特點 相對于傳統PCR技術，qRT-PCR技術具有高靈敏度、高效率、高準確性等優勢。qRT-PCR技術將傳統的PCR技術、熒光標記技術和激光技術進行融合，提高檢測的靈敏性；可在數小時內完成多個樣品的實時定量分析，大大地節約了醫務工作者的時間；采取針對性的靶序列鑒別定量分子，極大地提升了物體的特異性，提高實驗的精確度。

1.3 分類 qRT-PCR技術可以分為熒光探針和熒光染料，都是檢測擴增產物的增加量，使擴增的熒光分子信號與PCR產物的增加相一致。熒光探針是通過分離報告熒光基團和淬滅熒光基團，監測擴增的DNA鏈所形成熒光分子；熒光染料是在PCR技術過程中，加入熒光染料，使熒光染料滲入DNA雙鏈，從而檢測出熒光信號。

2 qRT-PCR技術在腫瘤中的應用

實時熒光定量qRT-PCR是一項新型的檢測技術，該技術的應用能夠使檢測從之前的“定性”轉變化為“定量”，而且具有強特異性，提高了檢測準確性，其操作簡便，基本能夠實現自動化，臨床上廣泛運用于腫瘤基因表達的檢測。腫瘤的實質是指人體細胞內的基因發生異變，是一種基因發生改變的疾病，這些不同的改變用熒光實時定量PCR技術都能夠檢測出來。尤其近年來qRT-PCR技術在預防、診斷以及治療腫瘤發生率較高領域(肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、宮頸癌等)方面最為盛行。

2.1 在肺癌相關特殊基因表達的臨床檢測 ZXF1在肺腺組織中的異常表達與腫瘤分化程度及淋巴結轉移有密切關系，在臨床中，其高表達可推測患者預后較差，并推斷ZXF1可能通過增強靶蛋白BMP-5和SCFR的表達而影響肺腺癌的進展，臨床運用qRT-PCR能夠靈敏精確地檢測ZXF1 mRNA的表達量[2]。表皮生長因子受體(EGFR)基因作為藥物治療肺癌的重要靶向基因，運用qRT-PCR法檢測EGFR的異常表達，具有易操作、快速高效、靈敏精確，且超低成本等優點，有益于臨床推廣[3]。王曉楠等[4]為了尋找高效的檢測肺癌早期診斷手段，收集肺鱗狀細胞癌患者28例，正常人10例，結果顯示，肺鱗癌患者與正常人外周血的鱗狀細胞癌抗原1(SCCA1)有差異，且具有統計學意義。表明了RT-PCR技術通過檢測肺鱗癌SCCA1 mRNA基因的表達水平，用于肺鱗癌患者的早期診斷，具有較高的臨床應用價值。楊上英等[5]通過對非小細胞肺癌(NSCLC)患者HLJ1基因進行qRT-PCR分析，顯示HLJ1基因在NSCLC患者癌組織的表達明顯低于癌旁組織，其差異有統計學意義(P=0.000)，結果表明qRT-PCR技術能準確檢測出HLJl基因在腫瘤組織中呈降低的趨勢，HLJl基因可能在NSCLC的發生發展過程中有著重要作用。王逸飛等[6]應用qRT-PCR技術檢測原發性肺腺癌患者基因變化情況，探討克唑替尼臨床運用治療，結果發現克唑替尼對于肺腺癌有著較高的控制率，表明了qRT-PCR技術通過檢測肺腺癌，能夠指導克唑替尼臨床應用。 以上在臨床檢測中運用qRT-PCR技術能夠更好地有助于肺癌的診斷與治療。

2.2 在肝癌相關特殊基因表達的臨床檢測 甲胎蛋白(AFP)是一種糖蛋白，是白蛋白家族中一種，主要由胎兒肝細胞及卵黃囊合成。胎兒期，甲胎蛋白血液循環中具有較高的濃度，出生后則逐漸下降，到2～3個月后甲胎蛋白基本被白蛋白替代，血液中較難檢出，故在成人血清中含量極低。甲胎蛋白與肝癌及多種腫瘤的發生發展密切相關，在多種腫瘤中均可表現出較高濃度，可作為多種腫瘤的陽性檢測指標。目前臨床上主要作為原發性肝癌的血清標志物，用于原發性肝癌的診斷及療效監測[7]。miRNAs除了在腫瘤組織表達外，在外周循環血液中，分泌尿液中，胸膜水中等也有所發現，且化學性質穩定，能夠持續監測。因取血運用qRT-PCR技術檢測操作簡單且創傷小，故有望作為腫瘤早期診斷標志物，而血清中miR-493-5p或miR-125b聯合AFP對肝細胞肝癌的診斷比兩者單獨使用更具有靈敏性和特異性，對早期診斷原發性肝細胞肝癌具有潛在的臨床意義[8-12]。另外運用qRT-PCR技術檢測血漿中的高爾基體蛋白73(GP73)、長鏈非編碼RNA(Long-chain non-coding RNAs,lncRNAs)HOTTIP和ROR在AFP陰性肝細胞癌中的診斷評估腫瘤細胞是否發生轉移有重要的臨床意義。因為早期肝細胞癌患者臨床癥狀不明顯，借助影像學和腫瘤單獨標志物易漏診，一旦發現已經處于晚期階段，喪失最佳治療時機，降低臨床生存率。所以運用qRT-PCR技術增加血漿中具有明顯變化的生化指標的檢測能夠提高AFP陰性肝細胞癌的早期診斷[13]。

2.3 在胃癌相關特殊基因表達的臨床檢測 癌胚抗原(Car-cinoembryonic antigen,CEA)是一種具有人胚胎抗原決定簇的酸性糖蛋白，胚胎期主要在胃腸道等器官，出生后含量很低，是一種廣譜的腫瘤標記物。其臨床主要檢測手段為qRT-PCR，對其實時定量檢測在血清中的濃度含量，用于腫瘤的鑒別診斷、病情監視、療效判斷等方面。糖類抗原199(Carbohydrate antigen 199，CA199)屬低聚糖腫瘤相關抗原，為一種新的腫瘤標志物，為細胞膜上的糖脂質。是血液中胃腸道腫瘤相關敏感抗原之一。如劉羽等采用qRT-PCR技術檢測胃癌患者外周血中CEA的高表達，與正常患者相比，具有顯著的統計學意義[14]。麗敏等檢測外周血中CEA、CA199、CA72-4、CA125等四種腫瘤標志物時，采用qRT-PCR擴增人端粒酶反轉錄酶基因段，然后再進行電化學發光法檢測大大提高了特異性和靈敏性[15]。qRT-PCR在胃癌生化檢測方面應用廣泛，除了以上經典指標外，如應用qRT-PCR技術檢測胃腺癌和正常胃黏膜組織SIX6 mRNA及miR-203的表達，結果顯示，胃腺癌組織SIX6 mRNA基因的表達明顯增高，在一定程度上調節腫瘤的形成和發展，表明了SIX6蛋白的表達與胃腺癌預后有關；在胃癌組織中，miR- 203處于低表達狀態，影響胃癌患者預后[16-17]。

2.4 在乳腺癌相關基因表達的臨床檢測 乳腺癌是女性常見并且多發的惡性腫瘤之一，與乳腺癌密切相關的腫瘤標志物有CA153、CA125、CEA、CA199等。這些腫瘤標志物在監測乳腺癌病情進展，以及了解治療的療效方面起著重要的作用，對于乳腺癌的診斷也起到一定的輔助診斷作用。但僅僅通過這些腫瘤標志物是不能確診的，生化指標往往是通過多種聯合方式，借助于影像技術手段，綜合考慮并確診。而聯合qRT-PCR技術監測乳腺癌相關基因表達有助于臨床診斷。 Mattie等[18]認為高通量qRT-PCR技術的出現，使miRNA成了一個獨立參數，能夠在活檢組織中檢測出ErbB2 miRNA的陽性與陰性，表明ErbB2 miRNA可以作為新的腫瘤標志物，應用于乳腺癌這樣活檢標本小的腫瘤。蘇謙等[19]應用qRT-PCR檢測血清miR-598-3p的表達水平，用化學發光法技術檢測血清CA153的水平表達，二者聯合檢測能夠提高診斷乳腺癌的敏感性和特異性。

2.5 在宮頸癌相關基因表達的臨床檢測 人乳頭瘤病毒(HPV)是一種球形DNA乳頭瘤空泡病毒，能引起人體皮膚黏膜的鱗狀上皮增殖。有研究表明，患有宮頸癌的女性中感染HPV病毒的比例占到90%以上，大部分人都是感染HPV病毒導致的宮頸癌。所以現代醫學對于HPV預防與檢測顯得尤為重要。qRT-PCR是當今較流行的一種監測技術，用于指導臨床診斷。如賈政軍等[20]采用qRT-PCR技術檢測 HPV mRNA 表達量，其表達量隨著宮頸癌的發展增加，呈正相關性，故可作為臨床檢測患者病情的發生發展及術后治療等指導依據。陳剛等[21]認為qRT-PCR是一種臨床檢驗技術，其對HPV-DNA的表達水平檢測可廣泛應用于臨床篩查宮頸癌預防與診斷的首選方法。臨床上，也可用qRT-PCR檢測宮頸癌鱗狀細胞癌中HIC1基因表達，結果表明qRT-PCR對于宮頸癌HIC1基因檢測具有準確度高的特點，針對該疾病早期診斷、癌變分型、預后判斷，HIC1基因的準確檢測有著重要的意義[22]。

3 結語與展望

傳統的PCR技術有cDNA與差異顯示兩大高通量技術，但是缺乏定量分析， 而qRT-PCR技術能夠解決這一問題，使檢測結果經過定量分析，從而得到差異性表達。腫瘤基因的突變和表達量的增加，在許多癌癥早期就出現。qRT-PCR技術不僅能有效地檢測出基因突變，還可以準確地檢測基因的表達量[23]。因此，qRT-PCR技術在臨床上具有廣泛的應用價值，能夠在腫瘤早期診斷、癌變分期分型過程中起到重要的檢測作用。有研究發現[24]，與傳統的DNA及mRNA表達的診斷方式相比較，通過qRT-PCR技術檢測miRNA，在時間與準確性上都能更好地發現并提示癌變。同時，miRNA作為重要的腫瘤抑制基因或癌基因，qRT-PCR技術還可以為癌癥的治療提供檢測手段，特異性敲除癌基因miRNA，從而抑制腫瘤的生長。目前，端粒酶hTERT基因、ER基因、MDRI基因等都能用qRT-PCR技術檢測，盡管腫瘤疾病的分子機制改變尚未明確，但基因的遺傳學異變則是腫瘤發病的根本原因之一，已得到普遍承認。

隨著研究技術方法的不斷創新、改進與完善，qRT-PCR將會在未來臨床疾病診斷、前沿科學研究等領域擁有廣闊應用空間及重要的地位，是生命科學研究中一種不可或缺的研究技術，該技術將于分子生物學、基礎研究醫學、疾病診斷、食品安全、藥物開發等一系列領域中得到更加廣泛的應用。