嚙齒類動物子宮內膜異位癥模型的研究進展*

時 光 趙瑞華

(中國中醫科學院廣安門醫院婦科，北京 100053)

子宮內膜異位癥(EM，簡稱內異癥)是指子宮內膜組織出現在子宮腔以外的部位，以疼痛、不孕、盆腔包塊為主要臨床表現的疾病[1-2]。5%～10%的育齡期婦女患有內異癥，且50%的內異癥患者合并不孕[2-3]。目前內異癥的發病機理尚不明確，應用有效的動物模型對內異癥的發病機制開展研究，并進行靶向治療尤為重要[4]。目前公認的內異癥發病機制是Sampson的經血逆流理論[5]，在此理論基礎上建立了多種內異癥模型。

內異癥動物模型建立方法包括兩種：一種為自發的動物模型，多是以非人靈長類動物作為研究對象建立動物模型，因其具有自發性的月經，與人的內異癥形成的經血逆流學說較為相似，更加符合內異癥的發病特點，但由于模型建立耗時長，實驗代價較大，且有倫理限制，現很少應用；另一種為誘發的動物模型，主要的動物選擇為嚙齒類動物。本篇文章主要對誘發性子宮內膜異位癥模型進行綜述。

1 造模前準備

在誘導動物模型之前，需要進行陰道分泌物的涂片以確定動情周期，選擇動情周期規律(至少檢測兩個連續4 d的動情周期)動物進行模型的誘導[6-8]。不同研究選用動情周期的不同期分別建立模型。研究中有選擇動情前期[6]，動情間期[7]或動情后期[8]進行子宮切除，認為動情后期或間期的內膜與人經期的內膜相似，從而模擬經血逆流的理論。另外，在模型建立之前，有些研究將動物進行卵巢去勢手術并給予雌激素或孕馬血清促性腺激素(PMSG)[9-14]，使大鼠處于統一的標準，且在造模前給予雌激素刺激子宮內膜組織的生長[15]，使其處于相同的卵巢周期，如動情期，從而排除個體動物因為不同的性激素水平而導致的子宮內膜病灶發展過程中的差異[16]。

2 動物模型的建立

2.1 同源模型的建立

同源模型中子宮內膜來源于嚙齒類動物的子宮，采用縫合或擴散的方式種植于腹腔。主要包括同種自體移植及同種異體移植。

同源誘導的內異癥模型最早為Vernon和Wilson[17]提出，主要為自體移植。腹部切口暴露子宮，切除一側子宮，縱向剖開，分為5 mm×5 mm的片狀，應用(6-0)的非可吸收線將內膜面垂直固定于腹壁。并于移植后的2周，剖腹檢查子宮內膜的黏附情況及活性。在Celik等[18]的研究中，從子宮角切除0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm的片狀內膜黏附于右側腹壁接近動脈的位置。在Rothmund等[19]的研究中，造模前給予所有的大鼠雌激素(50 μg/kg)每周兩次，開腹后，在子宮輸卵管處及子宮宮頸處結扎一側子宮角，縱形切口暴露內膜并且將子宮角分為4片，每片6 mm×3 mm。每側腹壁分別縫2片子宮角，內膜面朝向腹腔，關腹。內異癥誘導后14 d進行二次手術。

同種異體移植的方法主要是切除同源供體鼠的子宮，移植于受體鼠腹腔。研究中切除大鼠子宮，并將內膜層與肌層分開，子宮內膜碎片縫合在腹壁近血管處。術后3 d連續皮下注射雌激素[20]。在Taniguchi等[21]的研究中，供體鼠及受體鼠均行卵巢去勢手術并且皮下注射雌激素，在卵巢去勢2周后，切除供體鼠的子宮，縱向切開并切碎，切碎后加入500 μL鹽水，以1∶2供體子宮與受體子宮比例移植，并注入腹腔，每只鼠約注射50 mg的子宮組織。在Li等[11]的研究中，注射PMSG 48 h后，取供體鼠的子宮，分離子宮肌層后，將子宮內膜細胞懸液注入卵巢去勢的受體CD-1小鼠，輕柔的按摩使組織碎片擴散。術后2周及造模前4 d，受體小鼠皮下注射雌二醇，之后每4 d注射一次，維持內異癥的發展。

2.2 異源模型的建立

異源內異癥動物模型中，應用人子宮內膜組織腹腔或皮下注射到免疫缺陷的小鼠體內[22]。在Perelló等[23]的研究中，取婦科良性疾病手術婦女的子宮內膜種植于裸鼠體內。在Yesildaglar的研究中，內異癥患者的內膜細胞經皮下種植于嚴重的結合性免疫缺陷(SCID)的小鼠體內[24]。在Delgado-Rosas等[25]的研究中，將60 d緩釋的無菌雌激素膠囊植入36只卵巢去勢的裸鼠頸部。4 d后，取自然月經周期捐贈卵母細胞的無內異癥者新鮮的子宮內膜。將子宮內膜切成3 mm×3 mm的碎片，應用黏合劑將內膜碎片貼于每只小鼠的腹壁。在Herington等[12]的研究中，在無胸腺的裸鼠進行卵巢去勢手術后5～10 d，將人的內膜組織腹腔注射建立動物模型。提供者取增殖期的內膜樣本[26]。提供內膜的女性需要有規律的月經周期，無藥物治療史或手術分離黏連或內膜疾病或內異癥病史，血清孕激素<1.5 ng/mL，并排除近3個月內有激素治療的或其他的可能影響研究結果者[12]。

3 新型的子宮內膜異位癥模型建立

3.1 熒光標記子宮內膜異位癥模型

一些模型應用綠色熒光蛋白GFPcDNA作為供體或受體在位內膜組織的標記物[7, 13, 15, 27-30]。應用綠色熒光蛋白小鼠移植的內膜碎片移植到腹腔，可以幫助分析形態學改變及血管生成的過程。病灶多為囊性和血管生成，形態學標志如子宮內膜腺體和間質[28]。在異源的模型也應用熒光作為標記物，卵巢去勢及激素替代的裸鼠注射熒光標記的人子宮內膜碎片[31]。

3.2 腹腔鏡輔助子宮內膜異位癥模型建立

近年來有學者通過使用腹腔鏡的方法建立子宮內膜異位癥模型。在Peterse等的研究中，從小鼠腹部尾端到劍突的3.5 mm切口，置入內鏡，在腹腔鏡引導下從動物的左右兩側置入兩個14 G的靜脈內導管，將1 mm3內膜片植入腹腔。左，右側腹壁各植入4片內膜，子宮底與遠端結腸之間植入2片內膜。操作持續時間為20 min[8]。Peterse的另一個實驗，通過錄像將腹腔鏡誘導子宮內膜異位癥的步驟展現出來。卵巢去勢的C57BL/6JRj小鼠模仿人的雌孕激素序貫(皮下注射100 ng 17β雌二醇3 d，休息3 d后，背部植入孕酮聯合皮下注射5 ng 17β雌二醇)人工周期的方法，后應用芝麻油的刺激誘導內膜的蛻膜化。孕激素撤退4 d后月經來潮[32]，取經期的子宮內膜，應用腹腔鏡的方法[8]將經期內膜種植于同源的受體小鼠的腹腔誘導內異癥產生[33]，該方法較準確地模擬了Sampson的經血逆流理論[5]。

3.3 嵌合人類/小鼠子宮內膜異位癥模型

在Brunertran的研究中，為了證明人免疫細胞在內異癥中的作用建立了嵌合人類/小鼠的實驗模型。取無內異癥月經規律的捐獻者的增生期子宮內膜組織，同時要求捐獻者滿足子宮內膜厚≥9 mm(經陰道彩超確定)，血清孕激素≤1.5 ng/mL。將獲得的內膜組織放入培養液中培養[34]，并從捐贈者50 mL的血樣本中分離人外周血單核細胞及中性粒細胞。在Rag2γ(c)小鼠進行卵巢去勢手術后迅速在皮下種植緩釋的雌激素膠囊。子宮內膜組織培養24 h后，注射小鼠體內。部分小鼠在人的內膜組織注射到腹腔前，注射單獨做過標記的人類淋巴細胞。通過實驗證明在小鼠體內，免疫細胞具有限制腹膜內疾病的能力，表明嚙齒類動物的免疫系統是具有防止內異癥發展的能力[14]。

3.4 其他部位的子宮內膜異位癥模型

內異癥的誘導模型中，除了將內膜組織縫合或注射進入腹腔外，還可以將內膜組織種植于其他部位誘導內異癥的模型。如將子宮內膜組織移植在腓腸肌建立肌肉內異癥模型。同時也可以將子宮組織縫于小腸系膜手術誘導子宮內膜異位癥[35-38]。

4 嚙齒類動物誘導內異癥模型的結果分析

在對動物進行模型誘導后，需要二次手術以確定模型建立是否成功。因研究不同兩次手術之間的間隔時間以1周、2周、3周、4周、6周、8周各異[8，16，18，22，39-40]。在Bruner-tran等[41]的研究中，不同時間人的內膜碎片觀察結果如下：人的內膜碎片在第4小時會與小鼠腹壁松散黏連，輕輕地用鑷子可以將組織分開。到第16小時內膜組織與小鼠的間皮緊密黏連，在組織不損傷的情況下不能將其分離。顯微鏡檢查表明小鼠間皮細胞與人體組織的明顯包裹，可能影響異位人內膜與小鼠腹壁表面穩定性。到第24小時，來源于人類組織的鼠源性新生血管生成明顯，到第5天病灶的血供建立。第10天大體觀察表明血管生成繼續發展，顯微鏡分析表明異位內膜組織重塑。

內異癥病灶進一步通過病灶的大小表現，較大的標記為“a”，較小的標記為“b”及總體的量，通過標準的公式進行計算：V=a×b2×0.5[42]。在人體組織腹腔內誘導5 d后，判斷腹腔黏連的有無及異位病灶的內膜增長的出現及發展。通過Lauder等[43]所描述的方法對黏連的數量、強度及分布進行評分。0分：無黏連；1分：薄型黏連；2分：多于1個的薄型黏連；3分：厚的黏連帶；4分：厚的表面附著黏連；5分：非常厚的血管生成的黏連或者多于1個表面附著黏連[41]。Quereda等對種植物的生長及內異癥的階段進行分級，分為4級。0級:無種植物體，或種植物較小未形成囊腫；Ⅰ級:種植物形成直徑<2 mm囊泡，或大于2 mm的堅實的組織；Ⅱ級:種植物形成直徑≥2 mm但<4.5 mm(小于種植最初的大小)的液性囊泡；Ⅲ級:囊泡的直徑與種植物最初大小相似，或比原始的種植物更大(≥4.5 mm)。實驗性子宮內異癥階段：微小，三種移植物的總的生長等級≤2；輕度，總的生長等級為3或4；中度，總的生長等級為5或6；重度，總的生長等級≥7。

5 嚙齒類動物誘導內異癥模型的評價

嚙齒類動物子宮內膜異位癥模型的優點是嚙齒類動物的成本相對較低并且比非人靈長類動物更容易獲得。同源模型中，選擇具有相似基因特點的近交系動物，避免異位組織的排斥反應[16]，有利于進行長期的研究，且具有可重復性。同源內異癥手術誘導模型具有完整的免疫系統，適合進行內異癥機制的研究，包括在位內膜及異位內膜，并且可用在研究藥物的功能和內異癥的免疫及炎癥反應。異源內異癥小鼠模型，一些裸鼠是以人類子宮內膜為基礎，沒有完整的免疫系統的，它們可以被用來評價疾病的病因及用于藥物和激素調節的治療性檢測[44]。

應用嚙齒類動物誘導子宮內膜異位癥模型最大的缺點是人與嚙齒類動物屬于不同物種，具有不同的生理特點，通過嚙齒類動物得到的結果是否適用于人仍然是具有爭議的。此外，部分手術步驟是值得懷疑的。嚙齒類動物沒有月經，內異癥必須通過自體移植子宮組織進行誘導，在大部分嚙齒類動物研究中，子宮碎片包括肌層，這樣可能會影響病灶的發展，并且當評價異位病灶的重量及大小的時候，肌層占一定比例。另外手術后產生的炎癥及可能存在其他的潛在的影響，未來研究中需要對腹腔手術步驟進行規范以確保造模方式的可信性[12]。

鑒于傳統剖腹手術中的問題，創新的應用腹腔鏡輔助造模的方法正在發展，與傳統的剖腹手術或盲目的腹腔內注入子宮內膜組織相比，創新的方法創傷更小，成功率更高[8]。同時通過腹腔鏡引導可進行可視化操作。子宮內膜碎片組織可以種植在內異癥病人典型的發病位置，增加了模型的比較醫學價值[45]。

6 結論

動物模型對于研究人類子宮內異癥的病理生理機制、疾病的發展和疾病的治療方法尤為重要。本綜述介紹了不同的建立子宮內膜異位癥模型的方法，并且介紹了不同方法的步驟及模型的結果，評價。當選擇一種動物模型的時候，應該考慮具體的影響因素，包括時間、花費、研究目的與使用的方法，視情況而定。