糖尿病小鼠的周圍神經病變檢測*

趙鉞沁 楊麗芬 周怡昆

(1. 昆明理工大學醫學院，昆明 650504)(2. 云南省第一人民醫院 昆明理工大學附屬醫院 內分泌代謝科，昆明 650032)

糖尿病周圍神經病變(DPN)是以持續高血糖為特征的代謝紊亂而損害周圍神經系統的疾病，是最常見的糖尿病慢性并發癥之一[1-3]。其危害性遠高于糖尿病本身，高達50%的糖尿病患者深受其害，病情嚴重甚至會致殘致死[4-5]。由于DPN發病機制不明，尚缺乏特異性病因治療方法[6-7]。

人體和動物在糖尿病前期就可能并發周圍神經病變[8]。嚙齒動物模型在糖尿病有關研究中應用普遍，DPN動物模型則是糖尿病動物模型隨病情進展而成。由于技術的進步，價格低廉、生長周期短且容易操作的小鼠逐漸成為研究DPN發生發展并評估潛在療法的重要工具，但相應的診斷方法尚無通用標準。目前，關于糖尿病小鼠神經病變的實驗性文章較多，但鮮見描述檢測神經病變方法的文獻。本文針對糖尿病小鼠模型和相關的神經病變檢測方法進行論述，旨在為進行糖尿病小鼠神經病變研究的科研人員提供參考。

1 糖尿病小鼠模型

糖尿病常見類型包括以胰島素缺乏為特征的1型糖尿病和以胰島素抵抗為特征的2型糖尿病，神經病變多發于1型和2型糖尿病[9-10]。1型糖尿病患者常見小纖維損傷，而2型糖尿病患者常見大纖維損傷。一直以來，糖尿病動物模型首選大鼠，但近年來小鼠的使用也越加廣泛。臨床上，雖然2型糖尿病患者居多，基礎研究卻多見于1型糖尿病小鼠模型。不過，兩種類型的糖尿病小鼠模型神經病變癥狀相似，如神經傳導速度減慢、熱痛過敏等[11]。然而，同一糖尿病類型的小鼠也會因品系、性別、造模方法的不同而出現疾病進程和癥狀差異。

糖尿病小鼠模型來源多樣，如自發性模型、藥物造模、轉基因技術等。自發性糖尿病小鼠模型(如NOD小鼠、ob/ob小鼠等)和轉基因模型的使用受到成本限制。而藥物誘導形成的糖尿病小鼠模型經濟實惠、操作簡便，是研究糖尿病及其并發癥的重要載體。糖尿病造模的常用藥物為四氧嘧啶(ALX)和鏈脲佐菌素(STZ)，其機理都是選擇性破壞胰島β細胞擾亂機體代謝從而引發持續性高血糖。ALX建立的模型穩定性差、模型死亡率高。相較之下，作用溫和、毒性小且模型存活率高的STZ使用更為廣泛[12]。STZ可以快速有效地誘發小鼠糖尿病，但單一的STZ注射誘導的模型與人類1型糖尿病病理特征和臨床癥狀更為相似[13]。高脂飲食是建立胰島素抵抗和肥胖的常見方法，聯合STZ使用能夠復制出符合2型糖尿病特點的小鼠模型[14-15]。但是，STZ的藥效有較大的批間差異，使用STZ需要設計完整合理的實驗并謹慎操作以保證其藥效的發揮，從而降低糖尿病小鼠的成模率、存活時長、胰島細胞損害以及神經病變進展的差異性。

2 感覺功能檢查

目前，普遍認為糖尿病性神經疼痛是周圍神經病變造成的，尤其糖尿病動物模型的神經病變主要特征是周圍神經功能受損[6]。研究顯示，少數糖尿病患者和部分DPN患者有疼痛癥狀[1]。人類糖尿病初期一般呈現痛覺過敏，到DPN臨床期發展為痛覺減退[6]。糖尿病小鼠也有類似現象，并且出現痛覺減退的速度更快[10-11]。糖尿病患者痛覺異常可能與大的有髓鞘A-纖維和小的無髓鞘C-纖維損害有關[16]。但由于糖尿病不同階段的神經病變程度不同，患者感覺過敏或減退的潛在機制尚不明確。糖尿病早期，針刺、溫度等不引起疼痛的正常刺激都可能誘發患者感覺異常，糖尿病小鼠也有相似情況。糖尿病小鼠感覺功能的評價方法多種，最常用的是觸覺和溫度覺的檢查。

2.1 觸覺檢查

觸覺檢查是基于對輕觸覺敏感的大的有髓鞘Aβ-纖維和對疼痛感知有關的小的無髓鞘C-纖維的檢查。糖尿病動物模型呈現強烈的觸覺異常疼痛，類似人類糖尿病患者常抱怨的觸壓不適[3, 17]。糖尿病小鼠發病后2～4周對Von Frey探針刺激的敏感性增加，到后期敏感性逐漸降低[18]。Von Frey法類似于臨床常用的Semmes Weinstein單絲檢查[19]，通過糖尿病小鼠的機械刺激敏感度評估觸覺狀態。手動Von Frey法以探針配合鑿孔工作臺，垂直刺激小鼠的足底。通過改變探針的粗細或伸出長度調整刺激力度，記錄小鼠出現縮足反射的時間(即潛伏期)和刺激力度(即閾值)[20-21]。潛伏期較短為機械性痛覺過敏，潛伏期延長即為機械痛覺減退。電子von Frey觸痛儀也能獲得相似結果且檢測快速、不受探針尺寸的限制[22]，但是尚不清楚與手動Von Frey法所測參數是否一致[11]。手動Von Frey法雖然有效合理，但是精確性不足且操作費時[23]，電子von Frey觸痛儀可能會成為觸覺檢測的主要工具。

2.2 溫度覺檢查

糖尿病患者周圍神經病變臨床特征明顯之前就已出現溫度覺異常。STZ-大鼠誘發糖尿病后1～3周即表現出熱痛過敏[24]，而小鼠多觀察到熱痛減退[11]。雖然溫度覺異常與糖尿病患者的慢性疼痛無關，但輕度DPN患者普遍伴有該癥狀。而且，當患者神經病變癥狀顯著時，周圍神經多半已發生不可逆的病理改變。因此，檢查機體對溫度刺激的反應對DPN早期診斷意義重大。常用的糖尿病小鼠溫度覺檢查方法有四種：①甩尾法，將熱源施加于小鼠尾尖，其尾巴從一側轉移至另一側的時間即為潛伏期[6]；②Hargreaves法，與甩尾實驗相似，唯一的不同是熱源施加在后爪，觀察小鼠后爪抬起的時間[8, 20]；③熱板法，先校準熱板(50±5)℃，使正常小鼠在10 s內發生縮足反射。然后，將糖尿病小鼠放至熱板，記錄其暴露于熱板產生舔足、縮足等反射的時間[4, 6]；④冷板法，與熱板法的差異在于溫度，冷板溫度一般在4 ℃左右，有人認為最佳溫度為5 ℃[6, 25]。雖然糖尿病患者神經損傷時存在冷、熱覺異常，但熱刺激比冷刺激更具優勢。傷害性熱閾值的測定多用甩尾法和熱板法，而熱板能精確設置多種溫度環境且小鼠能自由活動，減少了干擾和誤差。因此，多采用熱板法判斷糖尿病小鼠的溫度覺損害。不過，快速和慢速的溫度感覺傳導分別由Aδ-纖維和C-纖維負責，單一的溫度感知實驗不能完全詮釋溫度覺異常，因此多種方法聯用可能更具參考價值。

3 神經電生理

神經傳導速度(NCV)減慢是糖尿病患者早期神經功能紊亂的特征之一[26]，糖尿病動物NCV也有不同幅度的降低[27]。神經電生理是通過NCV診斷周圍神經病變的金標準，也是DPN檢查的重要手段[28]。NCV檢查包括三種方法[29]：①體內直接檢測，將經藥物麻醉的糖尿病小鼠固定，刺激電極插入其后肢坐骨神經切口，在同側坐骨神經處的踝關節插入記錄電極，并將參考電極置于刺激和記錄電極之間，通過脈沖波刺激神經，記錄小鼠產生的復合動作電位[4, 30]；②體內間接檢測，與體內直接檢測的不同在于，記錄和刺激電極均作刺激電極，并將記錄電極置于小鼠腳趾第一骨間肌肉處[29]；③離體直接檢測，解剖小鼠分離坐骨神經。刺激電極置于坐骨神經結節處，記錄電極置于踝關節處，參考電極位于其他兩種電極之間[31]。

神經傳導速度(NCV)檢測廣泛用于疾病診斷和動物實驗，促使該法在糖尿病小鼠神經病變研究中得以推廣。糖尿病小鼠發病后可見NCV異常[32]，并且發生神經傳導功能障礙的速度很快。隨著糖尿病小鼠存活時間延長還呈現輕微的結構異常，這可能是糖尿病患者神經病變顯著的前兆[17]。然而，DPN早期多累及小纖維神經，甚至早于大纖維受損或電生理證據。NCV只能反映大神經纖維的功能狀態，對小神經纖維及無髓鞘神經纖維的病變不敏感，這也造成了 DPN 臨床檢出率偏低[9]。所以，單純的神經傳導功能完好難以排除DPN的存在。而且，DPN是動態的進行性疾病且多發于急性代謝紊亂期，多種神經功能損傷都是可逆的，并且人體與動物NCV異常的發生機制可能不同，因此糖尿病小鼠NCV檢測的參考價值還有待商榷。

4 病理學檢查

DPN發病率高且起病隱匿，其病理變化與臨床表現往往不一致。進行性結構異常是DPN患者的主要病理學特征如軸突變性，引發多種臨床體征和癥狀如疼痛、麻木和感覺異常[1, 9]。DPN發展涉及神經元、雪旺細胞和神經纖維的喪失或退化等[17]，糖尿病小鼠的神經病變研究也有類似發現。病理學檢查是評價DPN病情的標準之一，坐骨神經、足部皮膚和背根神經節(DRG)是研究糖尿病小鼠神經病變病理改變的常用樣本。

正常的坐骨神經有髓神經纖維髓鞘均勻密集、結構完整、排列規則而層次分明，且軸索功能完好、神經絲豐富，神經內膜結構正常。糖尿病小鼠隨著病情發展，坐骨神經逐漸出現組織學損傷如有髓神經纖維分布稀疏、神經內膜水腫和軸突變性等，甚至某些神經肽物質如P物質水平顯著下降[33]。通過HE染色、甲苯胺藍染色等便可觀察坐骨神經的病理變化[34-35]，但很難明確定量有結節區域的神經纖維變化。

泛神經元標記物PGP 9.5為神經元和神經纖維特異性標記蛋白，能夠診斷小神經纖維損傷，其免疫反應顯示糖尿病患者神經纖維明顯變薄[36]。對足底皮膚的檢測常用PGP 9.5抗體來實現表皮神經纖維(IENF)的可視化和定量檢查[20]。人類IENF密度降低與振動覺等神經功能障礙及神經病變程度相關。在糖尿病小鼠發病后2～8周也可見IENF顯著減少， IENF丟失可能是DPN早期指標[33, 37]。有人提出IENF損失造成熱覺喪失，但IENF的完整性與痛覺異常的一致性，還有待驗證[33]。

DRG是痛覺傳入的初級神經元，影響著不同形式感覺(痛覺/溫覺/觸覺)的傳遞。DRG神經元異常可能是糖尿病患者并發DPN的原因。糖尿病小鼠神經病變早期，DRG便有神經元細胞損傷，并隨病程延長而加重[38]。諸多糖尿病性神經病變實驗也顯示糖尿病小鼠的DRG部分細胞凋亡和神經元丟失[39]，可能與痛覺減退有關。TdT原位細胞凋亡法、HE染色等能夠檢測DRG神經元細胞的改變[40]。此外，轉錄激活因子3(ATF3)是神經損傷的神經元標記物，現已廣泛作為DRG受損的指標，可以通過免疫染色檢查其表達情況，進而評價初級感覺傳入纖維的應激水平[41-42]。

5 運動功能檢查

DPN患者早期并無明顯運動缺陷[43]，運動障礙多數在疾病后期出現甚至伴有嚴重病態包括足部或腳踝骨折易感性、足潰瘍和截肢，引起步態異常和肢體不協調[19, 44-45]。糖尿病小鼠運動功能檢查常用方法有步行軌跡法、斜坡試驗和轉棒試驗三種。

坐骨神經功能指數(SFI)是評估周圍神經功能的常用參數，經藥物治療后糖尿病大鼠的SFI改善明顯[46]。步行軌跡法基于動物足跡來獲取SFI進而評估坐骨神經功能，以不同顏色的液體對糖尿病小鼠前后爪著色，將其放在鋪有固定尺寸的白紙的行走箱中自由行走[46]。測得小鼠腳趾展開度、腳趾間距離、足跡長度等步態參數通過Bain公式來計算SFI了解其神經功能狀態[47]。該法操作簡單，但依賴于有色液體和紙張獲得足跡，易產生偽足跡、變形足跡，難以獲得精確數據和動態步態信息。Fricker等自制一套SFI紅外線評估系統，通過紅外裝置和相機捕捉動物的足跡。該系統價格低廉還能使SFI數字化，并提供糖尿病鼠的動態足跡，降低實驗重復次數與實驗動物使用量[48]。不過，這一儀器尚未普及，實驗效果有待考查。

斜坡運動是通過小鼠在一定角度的斜坡上保持平衡的時間來研究四肢運動神經損傷程度和治療時期的體位維持能力的方法。設計一定尺寸的玻璃水槽，在其內部鋪蓋粗糙橡膠墊。將糖尿病小鼠置于水槽中間，其身體軸線垂直于橡膠墊斜坡3～5 min，使之適應環境。然后，勻速調整橡膠板來改變斜坡角度，記錄小鼠滑動2 cm和保持體位5 s的最大傾斜角度，從而評價小鼠的運動協調能力[49]。

Heyser等曾用轉棒試驗檢測可卡因對小鼠運動能力的影響[50]。糖尿病小鼠的轉棒試驗表現正常，表明其無運動缺陷[11]。轉棒試驗是檢測糖尿病小鼠肢體協調運動最常用的方法[45]。轉棒是懸掛于基座的系列圓桿，正常小鼠在圓桿上轉動數分鐘，而糖尿病小鼠神經病變后可能出現協調能力缺陷，容易從圓桿跌落，小鼠的跌落時間可以評價其神經病變的嚴重程度。

6 角膜觀察

角膜共聚焦顯微鏡觀察角膜神經狀態是診斷糖尿病患者早期周圍神經病變的非侵入性手段[51]。由于角膜神經與下肢神經功能、其他神經功能檢測結果的相關性還存在爭議，角膜神經的改變尚不能作為DPN的可靠指標[52]。但是，臨床發現糖尿病患者角膜損傷隨病程發展而加重[53]，動物實驗也顯示角膜神經損失速度與糖尿病的嚴重程度有關[20]。近年來研究顯示，糖尿病小鼠的上皮下角膜神經顯著減少[8, 20]。角膜共聚焦顯微鏡還可以跟蹤觀察小鼠角膜神經的進行性消耗，未來可能成為定量診斷糖尿病周圍神經病變的一種高敏感性、高重復性且非侵入性方法。

7 總結

糖尿病小鼠在糖尿病發病后2～8周就有類似人體DPN的早期癥狀如感覺過敏或減退、IENF丟失等，并且其繁殖周期短、價格適宜、操作方便，這使其成為DPN研究的重要工具。但是，在DPN研究中任何小鼠模型的大小都是難以避免的缺點(如足部面積小使得觸覺檢查不易進行)，這可能妨礙實驗數據的準確采集。并且，小鼠壽命也限制了我們研究DPN的長期變化[3]。此外，由于STZ-小鼠在無干預措施的情況下，也可能恢復正常的血糖水平，我們還需密切監測小鼠血糖水平的波動。

關于糖尿病小鼠DPN的篩查方法很多，但暫無統一標準，感覺、神經電生理和病理學檢查是最基本的方法。感覺檢查簡單可靠且敏感性較高，但該法基于小鼠機體不適的指標如舔足、縮足等，這些行為存在個體主觀性，與刺激強度、疼痛感知不完全相關。神經電生理法具有良好的重復性、客觀性，但無法評估小神經纖維損傷且操作費時。病理學檢查可以評估多種纖維類型包括其他方法難以評估的小的無髓纖維，是量化小神經纖維病變可靠且可重復的方法，能夠彌補感覺和電生理檢查的不足。不過要獲得準確的病理學診斷, 需要保證取樣準確性。運動學檢查的參考價值不如其他方法，多作為輔助手段來排除運動缺陷造成小鼠在其他實驗中表現欠佳。糖尿病小鼠周圍神經病變的檢查方法各有利弊，因此在實際應用中，多種方法聯合應用對我們深入探究DPN的發生發展具有重要意義。