抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元自噬與PTEN的表達(dá)

趙俊華， 王海濤， 劉 浩， 艾莉波， 郭艷華， 徐愛軍

目前抑郁癥(depression)是第二大導(dǎo)致全球疾病負(fù)擔(dān)的疾病[1]，但發(fā)病機(jī)制尚未明確。海馬體主要負(fù)責(zé)記憶和情感控制，抑郁癥會造成海馬損傷體積縮小。研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥模型大鼠海馬神經(jīng)元存在顯著自噬[2，3]；抑郁癥模型動物突觸明顯損傷并伴有數(shù)量減少[4]；抑郁癥海馬神經(jīng)元突觸可塑性顯著改變[5]，這些改變可能是造成其海馬神經(jīng)元損傷及抑郁癥發(fā)病的重要因素。第10號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)的脂質(zhì)磷酸酶活性[6～8]，主要可使三磷酸肌醇(PI3P)脫磷酸為二磷酸肌醇(PI2P)，從而拮抗磷脂酰肌醇 3 磷酸激酶(PI3K)，通過抑制PI3K/ Akt /mTOR 信號通路的作用[9]，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，為自噬的正調(diào)控因子[10]。突觸前自噬可促進(jìn)突觸功能和突觸的可塑性[11]。而PTEN也參與了成年后突觸可塑性過程[12]。PTEN在突觸上直接作用的改變可能導(dǎo)致突觸功能障礙，從而導(dǎo)致行為和認(rèn)知后果[13]。研究[14]發(fā)現(xiàn)抑制PTEN可以改善正常的突觸功能和認(rèn)知，過表達(dá)PTEN的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出突觸抑制。可以推測抑郁癥海馬神經(jīng)元自噬、突觸可塑性改變以及PTEN蛋白的表達(dá)間可能互有關(guān)聯(lián)，然而尚未見有研究報道。本研究通過建立抑郁癥大鼠模型，檢測自噬相關(guān)因子LC3，Beclin1以及PTEN，觀察海馬神經(jīng)元自噬時是否存在PTEN的異常表達(dá)并探討相關(guān)性，為理解抑郁癥發(fā)病機(jī)理尋找新的視角。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 引物、SDS-PAGE凝膠試劑盒為北京莊盟國際生物基因科技有限公司合成；β-actin兔單克隆抗體為ABclonal公司生產(chǎn)；LC3兔多克隆抗體為MBL公司生產(chǎn)；PTEN小鼠單克隆抗體和Beclin1小鼠單克隆抗體為Santa cruz biotechnology公司生產(chǎn)。蛋白電泳儀及化學(xué)發(fā)光拍攝系統(tǒng)為Bio-RAD公司制造；激光共聚焦顯微鏡為Leica公司生產(chǎn)；實時熒光定量PCR儀為Roche公司生產(chǎn)。

1.2 動物分組及建立抑郁癥模型 取成年健康雄性SD大鼠共50只，體重180～200 g，由華北理工大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證編號：SCXK(京)2014-0004。適應(yīng)性飼喂7 d。隨機(jī)分為2組(模型組和對照組)，25只每組。模型組通過慢性不可預(yù)見溫和性應(yīng)激(CUMS)[15]方法制備抑郁癥大鼠模型。應(yīng)激包括11種，共持續(xù)21 d。每天隨機(jī)給與1到2種，每種應(yīng)激不超過3次，同種應(yīng)激方法不連續(xù)出現(xiàn)。對照組大鼠僅每天抓取一次。

1.3 行為學(xué) 曠場實驗檢測對陌生環(huán)境的探索欲：記錄其主動逃避時間和軌跡。Morris 水迷宮(MWM)檢測對尋找空間位置的學(xué)習(xí)和記憶能力：含隱蔽站臺實驗和空間探索實驗。隱蔽站臺實驗，記錄其游泳軌跡及尋找站臺時間，即逃避潛伏期(escape latency，EL)。隱蔽站臺實驗24 h后進(jìn)行空間探索實驗，撤除站臺，記錄游泳軌跡、穿越原站臺所在位置次數(shù)。懸尾不動實驗檢測抑郁狀態(tài)程度：對不動時間進(jìn)行統(tǒng)計。糖水偏好實驗評價動物快感缺失的程度：快感缺失的出現(xiàn)是抑郁癥動物模型造模成功的標(biāo)志。記錄大鼠的糖水和純水消耗以及總液體消耗。糖水偏好指數(shù)% =糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%。

1.4 免疫組織熒光 按不同時間點(0.5 d、1 d、3 d、7 d、14 d)分別將2組大鼠10%水合氯醛麻醉后，4 ℃預(yù)冷4%多聚甲醛經(jīng)心臟主動脈灌注固定，斷頭后冰上快速取腦。4%多聚甲醛4 ℃固定24 h后15%、20%、30%蔗糖梯度沉糖脫水。OCT包埋，-80 ℃冰凍，25 μm冰凍切片。10%胎牛血清室溫封閉45 min，一抗(LC3，1∶500；Beclin1，1∶500；PTEN，1∶500)37 ℃濕盒孵育1 h。熒光二抗IgG(1∶100)37 ℃濕盒避光孵育1 h。帶DAPI封片劑染核封片。激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.5 Western blot 按不同時間點(0.5 d、1 d、3 d、7 d、14 d)分別將2組大鼠麻醉后斷頭取腦。冰上快速分離雙側(cè)海馬，-80 ℃凍存，一側(cè)用于提取組織總蛋白，另一側(cè)用于組織總RNA提取。BCA法蛋白定量后按照30 μg蛋白量上樣，進(jìn)行15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF膜電轉(zhuǎn)印，8%脫脂奶粉封閉，一抗(LC3，1∶1000；Beclin1，1：1000；PTEN，1∶1000；β-actin，1∶10000)室溫孵育2 h，二抗IgG(1∶5000)室溫孵育1 h，ECL法顯色。LC3的表達(dá)水平以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值表示。目的蛋白的表達(dá)水平以目的條帶與內(nèi)參蛋白的光密度比值表示。

1.6 實時熒光定量PCR 取前述凍存的一側(cè)海馬組織，提取總RNA，用超微量分光光度計測定RNA濃度和純度。后參照試劑盒方案進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。實時熒光定量PCR反應(yīng)條件94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)檢測結(jié)果 曠場實驗：與對照組比較，模型組大鼠總路程、直立次數(shù)減少，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖1A、1B、1C)。

水迷宮實驗：與對照組相比，模型組大鼠顯示顯著的逃避潛伏期延長及總路程增加，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖2A、2C、2D)；穿臺次數(shù)顯著減少，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖2B、2E)。

穿梭箱實驗：與對照組相比，模型組大鼠主動逃避時間增加，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖3A、3B)。

懸尾不動實驗：與對照組相比，模型組大鼠懸尾不動時間顯著增加，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖4A)。糖水偏好實驗：與對照組相比，模型組大鼠糖水消耗比例明顯降低，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖4B)。

2.2 免疫組織熒光檢測結(jié)果 熒光鏡下：與PTEN和 Beclin1相結(jié)合的是Rhodamine標(biāo)記的二抗，594nm波長激光下發(fā)紅光。與LC3相結(jié)合的是Fluorescein的二抗，488nm波長激光下發(fā)綠光。紅色和綠色熒光二者疊加呈黃色，表示該部位存在目的蛋白共定位現(xiàn)象。可見模型組海馬神經(jīng)元PTEN與LC3蛋白呈共定位表達(dá)，Beclin1與LC3蛋白也呈共定位表達(dá)。與對照組相比，模型組紅綠色熒光亮度均較強(qiáng)，同時PTEN蛋白的表達(dá)量也增加(見圖5)。

2.3 Western blot結(jié)果 蛋白質(zhì)免疫印跡(見圖6A)：與對照組相比，模型組大鼠海馬PTEN、Beclin1與LC3的表達(dá)量在相同時相點均增高，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖6B、6C、6D)；與對照組相比，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值呈隨時間遞增趨勢，自0.5 d時小于1，至14 d時的大于1的翻轉(zhuǎn)，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(除1 d、3 d外P<0.01，見圖6E)。對照組內(nèi)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的值不同時相點兩兩相比無顯著差異(P>0.05，見圖6E)，模型組組內(nèi)各時相點LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的值兩兩相比(除1 d與3 d間相比無顯著差異外)差異顯著，均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖6E)。

2.4 實時熒光定量PCR檢測結(jié)果 大鼠海馬組織自噬相關(guān)基因Beclin1、LC3與PTEN的mRNA表達(dá)水平與對照組相比，各時相點模型組大鼠海馬組織Beclin1、LC3與PTEN的mRNA表達(dá)水平均增加，以Beclin1和LC3的mRNA增加更顯著，PTEN的mRNA增加次之，組間差異顯著，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖7A、7B、7C)。與對照組相比，模型組內(nèi)各時相點Beclin1、LC3的mRNA表達(dá)水平呈隨時間的下降趨勢，各時相點間差異顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖7A、7B)；而模型組內(nèi)PTEN的mRNA各時相點間表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05，見圖7C)。

A：曠場實驗各組軌跡(n=5)；B：曠場實驗各組大鼠直立次數(shù)比較(n=5)，**與對照組相比P<0.01；C：曠場實驗各組總路程比較(n=5)，**與對照組相比P<0.01

圖1 曠場實驗(n=5)

A：MWM實驗軌跡圖(n=5)；B：MWM隱蔽站臺實驗軌跡圖(n=5)；C：MWM 實驗各組總路程比較(n=5)，**與對照組相比P<0.01；D：MWM 實驗各組逃避潛伏期比較(n=5)，**與對照組相比P<0.01；E：MWM 實驗各組穿越原站臺次數(shù)比較(n=5)，**與對照組相比P<0.01

圖2 MWM實驗(n=5)

A：穿梭箱實驗各組軌跡比較(n=5)；B：各組大鼠平均主動逃避時間比較(n=5)，**與對照組相比P<0.01

圖3 穿梭箱實驗(n=5)

A：懸尾實驗中各組大鼠的平均不動時間的比較，**與對照組相比P<0.01；B：糖水偏好實驗各組大鼠糖水偏好指數(shù)比較，**與對照組相比P<0.01

圖4 懸尾實驗和糖水偏好實驗(n=5)

圖5 免疫熒光雙標(biāo)檢測各組 PTEN 和 Beclin1 分別與LC3共定位表達(dá)(n=5)

A：Western blot 各組大鼠海馬不同時相點各目蛋白的表達(dá)；B：模型組各時相點大鼠海馬組織Beclin1蛋白表達(dá)水平均上升，**與對照組相比P<0.01，*模型組內(nèi)各相鄰前后時相點間相比，Beclin1蛋白表達(dá)水平均升高，P<0.01；C：模型組各時相點大鼠海馬組織PTEN蛋白表達(dá)水平均上升，**與對照組相比P<0.01，*模型組內(nèi)各相鄰前后時相點間相比，PTEN蛋白表達(dá)水平均升高，P<0.01；D：模型組各時相點大鼠海馬組織LC3蛋白表達(dá)水平均上升，**與對照組相比P<0.01，*模型組內(nèi)各相鄰前后時相點間相比，LC3蛋白的表達(dá)水平均升高，P<0.01；E：模型組各時相點大鼠海馬組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值呈隨時間遞增趨勢，**與對照組相比P<0.01，*模型組內(nèi)各相鄰前后時相點間相比P<0.01

圖6 Western blot各組大鼠海馬不同時相點各目蛋白的表達(dá)(n=5)

A：模型組各時相點大鼠海馬組織LC3的mRNA表達(dá)水平均上升，**與對照組相比**P<0.01，*模型組內(nèi)各相鄰前后時相點間相比，LC3的mRNA表達(dá)水平降低，P<0.01；B：**與對照組相比P<0.01，模型組各時相點大鼠海馬組織Beclin1的mRNA表達(dá)均上升，*模型組各相鄰前后時相點間相比P<0.01，Beclin1的mRNA表達(dá)水平降低；C：**與對照組相比P<0.01，模型組各時相點大鼠海馬組織PTEN的mRNA表達(dá)水平均上升，*模型組各相鄰前后時相點間相比P>0.05，PTEN的mRNA表達(dá)無顯著差異

圖7 LC3、Beclin1及PTEN的mRNA表達(dá)水平(n=3)

3 討 論

本研究采用CUMS應(yīng)激建立大鼠抑郁癥動物模型更加真實的模擬了抑郁癥自然發(fā)病的過程，更為接近抑郁癥發(fā)病的真實情況[16]。采用多種行為學(xué)方法從多方面進(jìn)行驗證：曠場實驗中模型組大鼠對新環(huán)境的好奇心缺失；水迷宮實驗顯示模型組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力受損，長期記憶能力下降；穿梭箱實驗可見模型組行動軌跡與對照組相比明顯雜亂，說明大鼠學(xué)習(xí)記憶能力較對照組明顯下降；懸尾實驗中模型組大鼠存在明顯的行為絕望狀態(tài)；糖水偏好實驗顯示模型組大鼠存在明顯的快感缺失。這些結(jié)果均支持大鼠抑郁癥造模成功可靠。

本研究采用實時熒光定量PCR及蛋白質(zhì)免疫印跡法分別檢測了大鼠海馬神經(jīng)元目的 基因的mRNA及蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示與對照組相比，模型組大鼠海馬神經(jīng)元兩種自噬相關(guān)蛋白LC3與Beclin1與其mRNA表達(dá)水平均升高，顯示其自噬水平增高，提示抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)損傷細(xì)胞器及待降解的蛋白質(zhì)增加，通過增強(qiáng)自噬來清除和糾正。模型組各時相點LC3總蛋白及LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)呈隨時間上升趨勢，但實時熒光定量PCR結(jié)果中LC3的mRNA的表達(dá)呈隨時間下降趨勢，推測抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元LC3的轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)與翻譯環(huán)節(jié)存在某種未知機(jī)制的負(fù)反饋。LC3的mRNA表達(dá)最高時(0.5 d)LC3總蛋白及LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)較低，至LC3的mRNA表達(dá)最低時(14 d)LC3總蛋白及LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)反而較高，推測LC3基因在翻譯環(huán)節(jié)存在阻滯，導(dǎo)致了翻譯效率降低，阻滯在應(yīng)激解除后隨時間增加而逐漸減輕，LC3總蛋白及LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)增加。

另外蛋白質(zhì)免疫印跡顯示對照組不同時相點LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的值相對恒定，且各時相點LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)均低于LC3-Ⅰ的蛋白表達(dá)。而模型組LC3-Ⅱ蛋白從0.5 d時相點的微量表達(dá)顯且著低于同時相LC3-Ⅰ蛋白的表達(dá)，至14 d時相點的LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著升高并高于同時相LC3-Ⅰ的逆轉(zhuǎn)，推測抑郁癥大鼠應(yīng)激過程中海馬神經(jīng)元可能存在LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化環(huán)節(jié)的阻滯，并可能導(dǎo)致了自噬過程的障礙，解除應(yīng)激后這種阻滯隨時間增加而趨于糾正。另一種自噬相關(guān)基因Beclin1的轉(zhuǎn)錄及翻譯水平隨時間變化的趨勢亦與LC3的轉(zhuǎn)錄及翻譯水平變化趨勢類同，同樣佐證了上述猜想。

實時熒光定量PCR及蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示，抑郁癥模型組大鼠海馬神經(jīng)元PTEN基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平與對照組相比均上調(diào)。PTEN蛋白表達(dá)也呈上升趨勢，與Beclin1蛋白表達(dá)時間趨勢相近。前人研究表明PTEN可對自噬進(jìn)行調(diào)控[17，18]，PTEN為細(xì)胞自噬的正調(diào)控因子[19]。因此推測PTEN蛋白表達(dá)上調(diào)對抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元自噬起到了協(xié)同或促進(jìn)的作用。與對照組相比，模型組各時相點的大鼠海馬神經(jīng)元PTEN的mRNA均上調(diào)，但并未出現(xiàn)與PTEN蛋白表達(dá)相似的隨時間變化趨勢，而是呈平穩(wěn)的狀態(tài)，推測PTEN基因的翻譯環(huán)節(jié)也存在一定程度的阻滯。PTEN位于通路的上游，對自噬的調(diào)節(jié)效應(yīng)可能會經(jīng)由通路各環(huán)節(jié)逐級放大，或可解釋PTEN的mRNA上調(diào)的程度與Beclin1及LC3的mRNA相比較低的現(xiàn)象。這一點也使得PTEN可能成為對自噬調(diào)節(jié)更為靈敏高效的靶點。

本研究組織免疫熒光雙標(biāo)方法觀察自噬相關(guān)蛋白(Beclin1及LC3)與PTEN蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示在抑郁癥模型組大鼠海馬神經(jīng)元PTEN 和Beclin1分別與LC3存在共定位，推測PTEN蛋白與Beclin1也存在共定位。這些現(xiàn)象也提示PTEN很可能對抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元自噬發(fā)生與調(diào)控起了到重要的作用。

綜上所述抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元自噬增強(qiáng)現(xiàn)象與PTEN表達(dá)上調(diào)有關(guān)。PTEN可能是抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元自噬改變的重要調(diào)控因素之一。另外PTEN也可能經(jīng)由自噬途徑造成海馬神經(jīng)元突觸的重塑。這些均有待進(jìn)一步深入研究。