適用于結核分枝桿菌微測序耐藥基因芯片的多重PCR體系的優化與評價

孫照剛 李自慧 張洪靜 孫琦 潘麗萍 張宗德 許紹發

結核病耐藥性的快速診斷和全面診斷是當前結核病診斷領域的研究熱點。目前世界衛生組織(WHO)主要推薦基于PCR基礎上的Xpert MTB/RIF檢測和線性探針檢測(line probe assays，LPAs)技術作為耐藥結核病主要的分子檢測方法。前者雖然能快速、簡便地檢測利福平耐藥，但其主要缺點是費用十分昂貴，檢測耐藥種類少[1]；后者可以同時檢測利福平和異煙肼耐藥，以及新一代的GenoType MTBDRsl可以檢測氟喹諾酮類、氨基糖苷類和乙胺丁醇耐藥，但目前價格昂貴，需要專業技術人員操作，敏感性也略欠缺[2-4]。由此可見PCR技術是分子檢測的基礎，優化PCR技術不但可以降低成本，減少誤差，而且減輕技術操作人員的工作量，提高用戶體驗效果。

基因芯片技術是一類高通量分子檢測技術，對于PCR操作的每一步節省或減輕工作量都將大大提高工作效率。耐藥結核病基因芯片檢測是WHO認可的用于結核分枝桿菌(M.tb)耐藥性檢測的分子生物學方法[5]。前期我們報道了本課題組研發的微測序基因芯片技術[6]以及相應的一種多重PCR方法[7]，本研究擬進一步對前期建立的多重PCR反應體系進行優化，并評價其在利用結核分枝桿菌微測序耐藥基因芯片進行耐藥性臨床檢測中的優缺點。

資料與方法

一、標本來源

結核分枝桿菌臨床分離株來源于本單位的北京結核病臨床數據和樣本資源庫。痰標本來源于臨床檢驗后的剩余標本。

二、臨床分離株基因組DNA的提取

采用DNA小量提取試劑盒(51304，Qiagen公司)按操作說明提取菌株DNA。簡單操作如下：用TE緩沖液(pH8.0，含Tris-Cl 0.1 mmol/ L)，EDTA 0.5 mmol/ L重懸細菌，加入溶菌酶至5 mg/mL，37℃過夜振蕩消化，加入蛋白酶K至終濃度1 mg/mL，加入10% SDS至終濃度1%，37℃振蕩1小時，之后根據操作說明書進行過柱分離純化基因組DNA，并最終溶解于適量無菌去離子水，用Nanodrop2000(美國Thermo Scientific)進行定量檢測后，貯存于-20℃。

三、耐藥相關基因的引物合成

參考文獻[7]，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行引物合成。擴增的基因包括rpoB(409bp)、katG(635bp)、mabA/inhA(248bp)、embB(1111bp)、gyrA(423bp)、rpsL(373bp)、rrs(516 bp)和eis(567 bp)，以及pncA(上游：5′-GGTCATGTTCGCGATCGTCG-3′和下游:5′-ACAGTTCATCCCGGTTCGGC-3′，689 bp)各引物對擴增的條帶大小在凝膠電泳時區分較為明顯。

四、PCR擴增及測序

PCR擴增采用的Taq酶購于北京康為世紀生物科技有限公司(CW0654A)，dNTP購于天根生化科技(北京)有限公司(CD111-02)。由生工生物工程(上海)股份有限公司完成PCR產物的雙向測序。采用瓊脂糖凝膠進行電泳。為便于計算成本，所用的耗材0.5～10μL盒裝滅菌短吸頭、200μL槍尖(無RNase)、96孔PCR反應板及其封口膜等均購自Axygen公司。每個樣品重復2次，共做了3批144個標本，每批操作為48個標本。采用(NH4)2SO4來調節NH4+的濃度，同時采用二甲基亞砜(DMSO)，兩者都具有促進特異性PCR反應的作用。

五、主要儀器

生物安全柜(NU-425-300E，美國Nuaire公司)，基因擴增儀(My Cycler，美國Bio-rad公司)，凝膠成像系統(GelDoc XR，美國Bio-rad公司)，核酸分析儀(Nanodrop2000，美國Thermo公司)

結 果

一、九個耐藥相關基因擴增的單管PCR擴增

根據引物的設計結果，煺火溫度采用62℃，反應體系為常規反應體系(表1)，每條引物的摩爾數基本相同。由(圖1)可以看出，各基因的PCR產物亮度不同。根據亮度，我們推測在該煺火溫度下，各引物對都能正常與模板結合，但是效率不同。因此，為了達到各基因的PCR反應產物接近相同，我們在多重PCR反應體系中需要調整引物的比例。

表1 結核分枝桿菌耐藥基因的擴增普通PCR反應體系

圖1 濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳

1～10分別為：空白對照、katG、inhA reg、rpoB、gyrA、rrs、embB、rpsL、pncA、eis。M,marker，條帶分別2000/1000/750/500/250/100 bp。

二、多重PCR擴增

1 多重PCR(2管擴增9個目的基因) 根據所擴增的9個目的基因的片段大小，我們對多重PCR所用的引物進行了合理組合。圖2 顯示的是分別采用6:3組合(圖2 A)和5:4組合(圖2 B)都能收到良好的擴增效果。但是5:4組合的電泳結果更清楚。經二代測序證明，各產物之間比例恰當，產物為需要擴增的目的基因。

圖2 濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳

1包含6對基因引物(具體名稱省略)；2包含3對基因引物(具體名稱省略)；3包含5對基因引物(具體名稱省略)；4包含4對基因引物(具體名稱省略)。 M1,marker，條帶分別600/500/400/300/200/100 bp；M2,marker，條帶分別2000/1000/750/500/250/100 bp。

3 耐藥基因擴增多重PCR體系的痰標本驗證 采用135株臨床分離株進行DNA提取后的PCR擴增，結果所有標本均能清楚的看到9條目的基因條帶。對150個臨床痰標本進行DNA提取，經Nanodrop測定核酸的量發現有DNA的陽性標本為36個，PCR擴增和電泳的結果證明有大約29(80.56%)的標本能夠擴增出目的條帶，其余標本擴增不全，缺少個別的條帶。

表2 結核分枝桿菌耐藥基因的優化PCR反應體系

注：根據前期PCR產物中各條帶的亮度，調整引物的量，增加弱帶的引物量，降低強帶的引物量。

圖3 濃度為3.5%的瓊脂糖凝膠電泳

1包含5對基因引物；2包含4對基因引物。3包含6對基因引物；4包含3對基因引物； M1,marker，條帶分別600/500/400/300 bp；M2,marker，條帶分別1000/750/500/250 bp。

4 耐藥基因擴增多重PCR體系的效率優勢 與每個耐藥基因都需要單管PCR擴增相比，本研究創立的多重PCR擴增方法能夠縮短操作時間，減少所用耗材，提高擴增效率，減少人為操作失誤率。此外，在需要樣品運輸至第三方檢驗時還可以節省物流成本。

表3 平均每48個標本的操作效率比較

討 論

結核分枝桿菌耐藥檢測芯片是一種高通量的檢測多藥耐藥的芯片技術，該技術目前主要以雜交法為主[8-10]，但是雜交法具有操作復雜、耗時長等缺點，而以微測序技術為原理的芯片技術，能夠較好的克服了芯片檢測技術的多數缺點。前期我們的研究結果表明微測序耐藥基因檢測芯片具有較好的敏感性、特異性和一致性，此外，微測序芯片技術傳統的雜交法芯片檢測技術具有操作方面、快速等優點。本研究針對微芯片耐藥檢測技術中利用PCR制備芯片檢測樣本環節進行了優化操作和成本計算等評價，以提高對微測序基因芯片檢測結核耐藥性的認識。

為了驗證優化后的多重PCR反應體系，本研究分別以羅氏培養的菌體和痰菌為研究對象，經過Nanodrop驗證，全部的培養菌株都可以提取到基因組DNA并且多重PCR能夠擴增出所有條帶；而經nanodrop確認后的痰標本有80.56%能夠擴增出全部條帶，多重PCR不能擴增出的條帶沒有規律性，是否與模板量有關尚需進一步研究[13]。本研究雖然對多重PCR的成本進行了計算，但是本研究中的計算僅僅是為了有一個比較，并不具有完全的價格代表性。例如，多重PCR操作時間受所用加樣設備和試驗條件的影響較大；耗材和試劑受產地以及供貨渠道的影響也較大，而失誤次數更是與操作人員有密切關系。但是這并不影響對多重PCR具有優勢的判斷。對多重PCR體系的優化應當還具有一定的進步空間，但是本研究只做了關鍵部分嘗試，今后還需進一步完善和改進。