miR-147在肺腺癌中的表達及意義

石瑞瑞 王曉軍

肺腺癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，近年其發(fā)病率呈升高趨勢。浸潤性腺癌是病變進展的結果，其發(fā)生機制尚不完全清楚。近年學者關注分子表達異常與腫瘤形成的關聯(lián)性，同時也發(fā)現(xiàn)微小RNA(miRNA)可能是對腫瘤的形成有重要作用[1]。我們在miRNA基因庫中進行篩選，發(fā)現(xiàn)miR-147可能與肺腺癌相關，其可能具有調節(jié)增殖、轉移及血管形成的作用[2]。因此我們應用實時熒光定量PCR法檢測肺腺癌中miR-147的表達，關注其與細胞增殖和血管內皮生長因子的關系，探討miR-147與患者的預后的關系，以其為研究肺腺癌的形成和進展提供實驗數(shù)據(jù)。

資料與方法

一、臨床資料

選取2015年01月-2015年07月期間的65例肺腺癌患者作為研究對象。納入標準：①首診患者，且符合WHO中肺浸潤性腺癌的診斷標準，并經(jīng)病理醫(yī)生復核切片確診；②臨床隨訪資料完整。排除標準：①診斷不明確的患者；②肺部手術史；③合并嚴重感染的患者。本研究經(jīng)倫理委員會批準同意，并符合赫爾辛基宣言中的相關要求。患者或家屬簽訂知情同意書。本組中男35例，女30例，年齡42～87歲，平均66.2±11.9歲。選擇腫瘤組織作為觀察組，選擇距腫物邊緣>5 cm的正常肺組織作為對照組。均留取術后新鮮組織(-80度冰箱保存)和石蠟包埋組織。

二、方法

1 miR-147的檢測方法 應用新鮮凍存標本進行miR-147的檢測。檢測方法為實時熒光定量PCR法。首先提取組織中的總RNA。miR-147引物設計：上游：5＇-CTATCGGGAACGACCG-3＇，下游：5＇-ACACATTGAAGGTCCCCTT-3＇。應用U6作為內參。PCR反應設定：95℃ 5 分鐘，循環(huán)1次；95℃ 25秒，64℃ 20秒，72℃ 20秒，15個循環(huán)；93℃ 25秒，60℃ 35秒，72℃ 20秒，35個循環(huán)。于60℃時收集熒光信號，記錄Ct值。應用2-ΔΔCt法計算目的基因表達水平。ΔΔCt=[Ct目的基因(未知樣品)-CtGAPDH(未知樣品)]-[Ct目的基因(校正樣品)-CtGAPDH(校正樣品)]。

2 免疫組化方法 Ki67和VEGF的試劑均購自北京中杉金橋生物技術公司。二者的檢測應用免疫組化二步法、DAB顯色。Ki67的表達部位是細胞核，選擇腫瘤細胞表達較為明顯的3個高倍(400倍)視野區(qū)域計算陽性率，取平均值。以Ki67的陽性率作為增殖指數(shù)。VEGF的評估方法：陽性部位為細胞質，選取3個高倍(400倍)視野，分別進行陽性率和著色強度的計分。陽性率：≤25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分。著色強度：無著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。二者相乘作為最終評分，分值為0～12分。均由病理醫(yī)師采用盲法進行判讀。

三、統(tǒng)計處理

應用SAS6.12進行分析，應用t檢驗、配對t檢驗、卡方檢驗、方差分析、線性相關分析及K-M生存分析，以P<0.05為差別有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、二組中miR-147表達的比較

二組中miR-147的表達量差別有統(tǒng)計學意義，即觀察組中miR-147的表達量明顯低于對照組(見表1，圖1)。

表1 二組中miR-147表達的比較

圖1 二組中miR-147表達的柱狀圖

二、 觀察組不同臨床病理特征中miR-147表達比較

觀察組中miR-147的表達在有無胸膜累犯、不同腫瘤最大徑、有無淋巴結轉移及不同TNM分期的表達中差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而在不同性別、年齡、分化程度的表達中差別無明顯統(tǒng)計學意義(見表2)。

表2 不同臨床病理特征中miR-147表達比較

三、觀察組中miR-147與增殖指數(shù)的關系

應用Pearson相關分析顯示觀察組中miR-147的表達與增殖指數(shù)呈負相關性(r=-0.48，P=0.022)。(見圖2，3)。

圖2 肺腺癌中Ki67的表達(IHC 200倍)

圖3 miR-147與增殖指數(shù)的關系

四、觀察組中miR-147與VEGF的關系

應用Pearson相關分析顯示觀察組中miR-147的表達與VEGF呈負相關性(r=-0.45，P=0.031)。(見圖4，5)。

圖4 肺腺癌中VEGF的表達(IHC 200倍)

圖5 miR-147與VEGF的關系

五、miR-147與生存時間的關系

患者隨訪的生存時間為7～48個月(48個月為終點時間)，共有2例失訪，中位生存時間29個月。生存分析顯示miR-147與生存時間有關(χ2=6.54，P<0.05)，即miR-147低表達患者的生存時間短，預后差。(見圖6)。

圖6 miR-147與生存時間的關系

討 論

近年微小RNA與腫瘤作用是研究的熱點，其主要在轉錄后調控中發(fā)揮重要作用。微小RNA可以通過結合靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)引起翻譯的抑制，直接調節(jié)腫瘤的增殖[3]。miR-147的異常表達與上皮源性腫瘤的發(fā)生有關。相關研究表明miR-147可能具有抑癌基因的作用[4]。柳家榮[5]等通過觀察miR-147在卵巢癌細胞系中的表達，發(fā)現(xiàn)miR-147可以靶向MDM2的表達，其過表達狀態(tài)可以抑制腫瘤細胞的增殖并誘導凋亡。肺浸潤性腺癌是高增殖性腫瘤，細胞增生明顯，預后差，微小RNA異常表達其發(fā)生密切相關。

本研究基于肺腺癌術后組織進行研究，結果顯示肺腺癌中miR-147的表達明顯低于對照組，提示miR-147低表達是腫瘤形成的分子因素，miR-147發(fā)揮抑癌基因作用，miR-147在細胞的異型增生過程的作用明顯，對調控細胞的失控性增生有較為明顯的作用。結果顯示肺腺癌中miR-147的表達與有無胸膜累犯、不同腫瘤最大徑、有無淋巴結轉移有關，提示miR-147低表達可以促進腫瘤的侵襲、生長和轉移，腫瘤處于進展狀態(tài)。結果顯示miR-147的表達與不同TNM分期有關，由于TNM分期提示腫瘤的預后和生物學行為，因此miR-147的表達可能與腫瘤的預后和判斷腫瘤的生物學行為有關。生存分析直接證實了此結論，即miR-147低表達患者的預后差。低表達的miR-147預示著腫瘤較高的臨床分期。結果顯示miR-147的表達與增殖指數(shù)呈負相關性，提示miR-147低表達時可以引起腫瘤細胞的異常增殖。miR-147的異常表達參與腫瘤細胞的失控性增生，引起腫瘤迅速生長，腫瘤體積增大，侵襲性增強[6]。miR-147對細胞增殖是直接作用，其受到明顯抑制后的作用也可能與對增殖相關基因有關，如PCNA和CyclinD1等[7]。結果顯示miR-147的表達與VEGF的表達呈負相關性，提示miR-147低表達時可以促進VEGF的表達，進而調節(jié)腫瘤間質的血管生成，使局部的營養(yǎng)和氧的供應增加，腫瘤細胞生長活躍[8]。體外研究顯示miR-147高表達時對細胞周期可出現(xiàn)明顯的抑制，有學者將miR-147轉染進入腫瘤細胞后，位于G0/G1期的細胞比例升高，細胞的增殖程度下調，凋亡因子表達升高，腫瘤呈抑制的狀態(tài)[5]。此結果與本研究結果的結論相似。miR-147可能對EGFR和TGF有明確的抑制作用，EGFR和TGF 可能是miR-147的下游因子，其活化后具有較強的臨床意義[9-10]，這也是miR-147對腫瘤調節(jié)作用之一。也有學者通過miRNA靶基因預測軟件TargetScan和miRecords發(fā)現(xiàn)miR-147的靶基因可能更多[11-12]，如整合素分子，因此miR-147的作用可能通過整合素介導的生物學通路發(fā)揮生物學作用，促進腫瘤的侵襲和進展，這個通路使miR-147在腫瘤促進作用中，也有對轉移的調控作用。miR-147也可能與炎癥反應因子及巨噬細胞反應有關，尤其是腫瘤相關巨噬細胞的功能。這也提示miR-147的作用可能更復雜[13]。因此對miR-147的研究不應當局限于某一個靶位或某幾個分子，對其進行多種基因的篩查及關聯(lián)性研究可能是揭示miR-147具體意義的重要方法，也可能為針對miR-147的靶向治療提供重要參考指標。本實驗發(fā)現(xiàn)的miR-147與生存時間的關系，需要后續(xù)進行多中心、大樣本及多因素的分析證實。

總之，肺腺癌中miR-147低表達是肺腺癌形成的重要分子事件，其參與腫瘤的進展，miR-147的作用與對細胞增殖和VEGF的調節(jié)有關，miR-147的表達可能與預后有關。