不同肺炎鏈球菌株毒力基因攜帶與轉(zhuǎn)錄水平差異及其與血清型的關系

張艷琳 熊昊

肺炎鏈球菌是一種常見的呼吸道感染或醫(yī)院獲得性感染致病菌，當人體的抵抗力下降時，可引發(fā)鼻竇炎、中耳炎、腦膜炎等疾病，其對于嬰幼兒和老年人的致病率更高。近年來，臨床開始使用肺炎鏈球菌疫苗來預防肺炎鏈球菌的感染，根據(jù)不同的血清型來選擇合理的疫苗，可更加有效地降低肺炎鏈球菌的感染率[1]。相關研究發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌毒力相關因子在致病菌引發(fā)侵襲性感染過程中發(fā)揮著重要作用[2]，對毒力基因的研究可為研制更加穩(wěn)定有效的肺炎鏈球菌疫苗提供可靠依據(jù)。目前，相關學者對肺炎鏈球菌毒力基因的類型及臨床分布情況進行了初步研究，但對國內(nèi)肺炎鏈球菌毒力基因的類型及其與血清型關系的研究則較為鮮見。基于此，本研究對本地區(qū)分離出的126株肺炎鏈球菌進行血清分型，并對其毒力基因類型和轉(zhuǎn)錄水平進行檢測，分析其相互之間的關系。現(xiàn)報道如下。

資料與方法

一、菌株來源及試劑

收集宜賓市第二人民醫(yī)院于2015年3月-2018年12月間從臨床感染患者中分離的肺炎鏈球菌126株，分別來自門診患者(19株)、兒科患者(33株)、ICU患者(31株)、耳鼻喉科患者(21株)和其他科室患者(22株)；其中，來自血液培養(yǎng)7株，來自痰培養(yǎng)114株，來自分泌物培養(yǎng)3株，來自腦脊液培養(yǎng)2株。分型抗血清來自日本生研公司，PCR和q-PCR相關試劑購自上海威奧生物科技有限公司，DNA提取試劑盒購自美國OMEGA公司。

二、方法

細菌DNA提取后，按照文獻[3]中具體步驟要求運用多重PCR進行肺炎鏈球菌株血清分型。

毒力基因檢測。細菌DNA提取后，按照PCR試劑盒說明書進行擴增，引物序列和長度(見表1)。PCR擴增反應體系含有dNTP(10mmol/L)2μL，DNA模板2μL，buffer(含Mg2+濃度1.5mmol/L)2μL，上下游引物(10μM)各1.5μL，Tag酶(每微升含5個單位)0.8μL，底物1μL。PCR擴增反應程序為95℃預變性5min后進行38個循環(huán)，主循環(huán)包括95℃變性30s，55℃退火40s，72℃延伸60s，循環(huán)結(jié)束后延伸72℃5min。應用1%的瓊脂糖凝膠電泳后對結(jié)果進行觀察。

表1 5個毒力基因普通PCR所用引物

毒力基因轉(zhuǎn)錄水平檢測。按照RNA的提取試劑盒說明書提取總RNA，按照RT-PCR試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板進行擴增，毒力基因引物序列和長度(見表2)。PCR擴增反應體系含有cDNA模板2μL，dH2O 6μL，Premix Ex TaqⅡ10μL，上下游引物(10μM)各0.8μL，ROX Reference DyeⅡ0.4μL。PCR擴增反應程序為95℃預變性1min后進行40個循環(huán)，主循環(huán)包括：94℃條件下進行30s變性，55℃條件下進行40s退火，72℃條件下進行60s延伸。毒力基因轉(zhuǎn)錄水平應用法進行計算。

表2 毒力基因定量PCR引物序列

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、血清型檢測結(jié)果

126株肺炎鏈球菌中，血清19F型 27株(21.43%)，3型21株(16.7%)，23F型 16株(12.7%)，6A/B型14株(11.1%)，14型11株(8.7%)，19A型7株(5.6%)，15A型4株(3.2%)，此外有26株(20.6%)未能定型。

二、毒力基因檢測結(jié)果

126株肺炎鏈球菌中，毒力基因lytA陽性 115株(91.3%)，ply陽性 118株(93.7%)，nanA陽性 120株(95.2%)，psaA陽性 112株(88.9%)，cbpA陽性 114株(90.5%)(見圖1～5)。

圖1 psaA毒力基因片段PCR電泳結(jié)果

圖2 nanA毒力基因片段PCR電泳結(jié)果

圖3 ply毒力基因片段PCR電泳結(jié)果

圖4 lytA毒力基因片段PCR電泳結(jié)果

圖5 cbpA毒力基因片段PCR電泳結(jié)果

三、不同血清型的毒力基因攜帶分布

7種常見血清型中，23F型、14型、15A型、19F型的毒力基因攜帶率較高；并且每種血清型中nanA 的攜帶率均不低于其他類型毒力基因，且lytA、ply、nanA、psaA、cbpA毒力基因在7種常見血清型中的陽性率總體差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)(見表3)。

表3 不同血清型的5種毒力基因陽性率

四、不同血清型的毒力基因轉(zhuǎn)錄水平比較

lytA基因轉(zhuǎn)錄水平在不同血清型之間無明顯差異(P>0.05)，3型血清型的nanA、ply、psaA和cbpA基因轉(zhuǎn)錄水平均明顯高于19F、23F、6A/B、14、19A血清型(P均<0.05)(見表4)。

表4 不同血清型的5種毒力基因轉(zhuǎn)錄水平

注：與19F、23F、6A/B、14、19A型比較，*P<0.05。

討 論

肺炎鏈球菌作為一種常見的病原菌經(jīng)常存在于人體的鼻咽部，人體攜帶時可暫時不致病，但當?shù)挚沽档蜁r，細菌會向身體其他部位擴散而導致鼻竇炎、中耳炎、肺炎、腦膜炎等疾病[2]。肺炎鏈球菌的血清型會根據(jù)地域的不同而產(chǎn)生變化。王穎童等[4]收集河北省兒童醫(yī)院的肺炎鏈球菌進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)最常見的血清型包括19F型、19A型、6A/B型、14型和1型。在本研究檢測的126株肺炎鏈球菌中，血清19F型 27株(21.43%)，3型21株(16.7%)，23F型 16株(12.7%)，6A/B型14株(11.1%)，14型11株(8.7%)，19A型7株(5.6%)，15A型4株(3.2%)，與上述河北地區(qū)的研究結(jié)果不完全相符，表明肺炎鏈球菌血清型分布具有一定的地區(qū)差異。

在肺炎鏈球菌的毒力基因中，lytA自溶素基因檢測的特異性最高，所以最適合用來鑒別肺炎鏈球菌。Ply具有一定的細胞毒性，可以通過抑制纖毛的定向擺動促進細菌向肺部遷移并侵入到血液中。本研究中的126株肺炎鏈球菌中，nanA、ply、lytA基因的陽性率分別達到95.2%、93.7%、91.3%，與國外報道的肺炎鏈球菌毒力基因檢測效果基本一致[5]。psaA是一種金屬結(jié)合脂蛋白，在肺炎鏈球菌中具有抗氧化應激和降低補體活性的作用[6]。cpba在肺炎鏈球菌中發(fā)揮著重要的黏附作用，促使病原菌進一步滲透入周圍的細胞組織[7]。nanA是一種神經(jīng)氨酸酶，是肺炎鏈球菌中的主要致病因子，也是公認的藥物有效治療的靶向因子，可有效反映細菌的增殖和擴散[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，常見血清型中，23F型、14型、15A型、19F型的毒力基因攜帶率高于其他血清類型；并且每種血清型中nanA 的攜帶率均大于或等于其他毒力基因，表明nanA在不同血清型肺炎鏈球菌的常見毒力基因中具有最高的檢出率，可作為首要的治療和防疫靶向因子。

分析不同血清型肺炎鏈球菌的毒力基因轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同血清型的lytA基因轉(zhuǎn)錄水平之間無明顯差異(P>0.05)，3型肺炎鏈球菌的nanA、ply、psaA和cbpA基因轉(zhuǎn)錄水平均明顯高于其他血清型(P均<0.05)。主要原因是，3型肺炎鏈球菌在增殖的過程中會產(chǎn)生更多的莢膜多糖，進而形成更強的抗吞噬功能；此外，3型肺炎鏈球菌更容易進入腦脊液進而引發(fā)炎癥，導致毒性基因的轉(zhuǎn)錄水平升高。但本研究的不足之處在于未能對不同血清型肺炎鏈球菌體內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平的差異進行研究，這在今后的研究中還需要進一步補充完善。

綜上所述，lytA、ply、nanA、psaA、cbpA毒力基因在7種常見血清型肺炎鏈球菌中普遍存在，血清型不同，其毒力基因的檢出率也存在不同程度的差異。